中，所述玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2的cDNA序列如SEQIDNo.l所示， 其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；该基因编码的氨基酸序列中含有sPLA2典型的PA2c结构域。该基因cDNA序列长575bp，推测其包含32bp的5'非翻译区（5'UTR)和107bp的3' 非翻译区（31TR)以及一个474bp的0RF。该0RF编码157个氨基酸，其分子量和等电点分别为 16.5kDa和5.16。在氨基酸水平上21118?1^2-2及21118?1^2-1、与其他植物的8?1^2有较高相似 性。ZmsPLA2-2在氨基酸水平上与水稻SPLA2-II相似性最高，为77%。但ZmsPLA2-2与 ZmsPLA2-l的相似性为26%，与ZmsPLA2-3的相似性为49%。
[0012] 所述的玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2有cDNA形式或基因组基因形式，其编 码序列可以正义形式或反义形式构建融合基因，后者用于植物转基因。所述的植物是指栽 培的草本作物，或玉米，或棉花，或牧草，或早熟禾;所述改变植物抗旱性是指提高或降低植 物的抗旱性。
[0013] 本发明所述玉米分泌型磷脂酶A2基因ZmsPLA2-2在提高植物抗旱性中的应用方法 大体是:从玉米中克隆ZmsPLA2-2基因，构建用于植物转化的表达载体，利用转基因技术生 产转基因植株;通过对转基因植株进行抗旱性测定，筛选出抗旱明显提高或降低的转基因 植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。具体是：
[0014] 玉米ZmsPLA2-2克隆和表达分析
[0015] 首先，从玉米基因组DNA或cDNA中克隆出ZmsPLA2-2基因，后者表达后产生一个157氨基酸的蛋白。具体步骤为：用水稻sPLA2基因家族的SPLA2-II在玉米的EST库进行BLAST， 得到序列C0442459。序列分析表明这条EST序列包含完整的0RF。采用PCR方法从玉米郑58的 cDNA文库中克隆出完整的cDNA序列，测序鉴定得的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，即确定 为ZmsPLA2-2基因的cDNA形式。利用获得的cDNA序列设计引物，采用PCR方法从玉米郑58基 因组中扩增出ZmsPLA2-2基因的基因组序列。
[0016]将ZmsPLA2-2基因cDNA的5'端序列在NCBI中进行BLAST，获得了一系列不同长度的 序列。取基因的起始密码子5'上游的2000bp的序列为启动子区域，利用plantCARE在线软件 (http://bioinformatics·psb·ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行分析，石角定了 在ZmsPLA2-2基因的启动子区域，DNA正链上分布有ABA、MeJA相关顺式元件各1个;负链上分 布有可能的干旱胁迫相关顺式元件4个，热胁迫相关顺式元件1个，ΑΒΑ相关顺式元件1个， MeJA相关顺式元件1个。提示ZmsPLA2-2基因的表达可能受干旱胁迫、热胁迫、ABA、MeJA等信 号的诱导，与植物抗逆性密切相关。
[0017] 为了确定ZmsPLA2-2基因的表达与植株生长发育和抗逆性的关系，提取正常栽培 条件下生长的玉米郑58的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊和籽粒的mRNA，使用随机六引物反转录合成 cDNA。根据已知序列的3'非翻译区或非保守区设计引物，进行RT-PCR，结果表明ZmsPLA2-2 在根和雄穗中表达量较低，在其他器官中表达量都较高。以Ubiquitin为内参基因，用2_a~t 的方法计算每个基因的相对表达量。在渗透胁迫处理条件下，ZmsPLA2-2基因表达量最高上 调2倍左右，它的表达受渗透胁迫诱导，即它参与了植株对渗透胁迫的响应。在冷胁迫处理 条件下，ZmsPLA2-2表达强度也上调，在4°C处理6h时表达量最高，在叶和根中上升到正常水 平的1.5倍和2倍左右。非生物逆境诱导条件下基因表达的水平的变化肯定了ZmsPLA2-2基 因的表达与植株抗逆性密切相关。
[0018] 玉米ZmsPLA2-2基因植物表达载体的构建
[0019]在植物中高效表达ZmsPLA2-2，需要将ZmsPLA2-2基因重组到植物表达载体中并应 用于植物转基因，产生工程植株。本发明提供一个玉米ZmsPLA2-2基因构建融合基因和植物 表达载体的方案，通过玉米、棉花、早熟禾等植物的遗传转化，产生抗旱性状发生改变的工 程植株，进而创制具有重要利用价值的新种质。
[0020]本发明所说的融合基因是由ZmsPLA2-2基因编码框与启动子和转录终止区连接形 成的基因表达结构，ZmsPLA2-2编码框可正向或反向位于启动子3'端、转录终止区5'端。启 动子可具有不同的启动特性，如胁迫诱导型启动子RD29A启动子、组成型启动子Ubiquitin 1启动子。
[0021]本发明通过PCR扩增出5'端带有Κρη I酶切位点、3'端带有Sac I酶切位点的ZmsPLA2-2正义基因或5'端带有SacI酶切位点、3'端带有ΚρηΙ酶切位点的ZmsPLA2-2反义基 因，经ΚρηΙ和SacI双酶切后回收该片段。同时对植物表达载体pCPE(改造的mini-Ti质粒)进 行ΚρηΙ和SacI双酶切，回收载体片段。将二者混合后进行连接反应，得到质粒pCPE-ZmsPLA2-2(± )。质粒pCPE-ZmsPLA2-2(± )的目的基因区含有1个BamHI酶切位点。用限制性 内切酶BamHI进行酶切鉴定，除载体条带外，质粒pCPE-ZmsPLA2-2( +)应有一条230bp电泳条 带，质粒pCPE-ZmsPLA2-2(_)应有一条383bp电泳条带。挑选出重组正确的质粒用于植物遗 传转化。
[0022] 玉米ZmsPLA2-2基因转化植物
[0023]本发明中，用含有玉米ZmsPLA2-2基因的植物表达载体转化植物。根据转基因受体 材料的特点选用不同的转基因方法以批量获得转基因植株。以下以玉米为例简述转基因植 物获得及筛选过程。
[0024]常用的玉米转化方法有3类：1)直接转化法，即提取重组质粒DNA，采用基因枪轰击 法、电融合法、硅碳纤维法等将质粒DNA导入细胞。2)农杆菌介导的遗传化方法。3)种系转化 法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，还有将不同类方法组合使用的转化程序，如将 基因枪轰击法和农杆菌结合使用以提高转化效率。以下以玉米自交系胚性愈伤组织为材料 采用基因枪轰击法进行遗传转化为例予以说明。
[0025]玉米自交系植株在自交授粉后9-15天，取果穗剥去苞叶后于70 %酒精中浸泡 5min，无菌条件下挑取约1.0-1.5mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、 淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养。每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织 作为遗传转化的受体材料。
[0026]本发明中，采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取1.Own大小的金粉，经70%乙醇 洗涤后静置15分钟，离心去除上清液;再用无菌水彻底清洗3次，然后50 %灭菌甘油(终浓度 为60mg/ml微弹）贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5μ1质粒DNA(lygAi 1)、50μ1 12.5MCaCl2、20yl0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2~3分钟，静置1 分钟。离心弃上清液后，加70%乙醇静置。然后离心弃上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在 微弹载体上。微弹用量为每弹〇. 5mg。
[0027]本发明中，在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度 放入培养皿中，每皿轰击一次。轰击参数取:可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网 的距离为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢 复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。 再将材料转入加有选择剂(如0.08%除草剂草甘膦）的培养基上进行筛选。连续筛选三代， 每代15天。继代时淘汰变褐死亡的组织块。抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光 照16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根 培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约l〇cm高时栽到大田中，自交结实。转基因植株通过 数代分子检测和自交结实产生纯系，然后通过抗性鉴定和田间选择获得转基因优异材料。 [00 28] 本发明中转基因植株的鉴定采用PCR检测法筛选，Southernblotting验证。即提 取除草剂抗性小苗叶片DNA用于PCR检测。根据筛选标记基因和目的基因ZmsPLA2-2的序列 设计引物，分别进行PCR检测。检测ZmsPLA2 - 2正义基因：上游引物：5 ' CGGTCGTTCATTCGTTCTAG3'，游引物：5'AGTCATTGTTGTGGGTGTCG3'。从转基因植株中扩增出 ZmsPLA2-2正义基因的715bp目的条带或反义基因的1044bp的目的条带。而未转基因的对照 植株（阴性对照)未出现相同大小的目的条带。可以推断这些PCR阳性植株基本是转基因植 株。再取后者叶片提取DNA用于Southernblotting验证，选取转基因植株自交繁殖。
[0029] 玉米ZmsPLA2-2转基因植株的选择及利用
[0030]本发明中，为了 了解转基因的表达强度和植株抗逆性变化的关系，选取PCR阳性的 遗传稳定的T2代转基因植株和未转基因对照为材料，提取叶片RNA，通过RealtimeRT-PCR 检测目标基因的表达强度。在玉米转基因材料检测中，以玉米Ubiquitin基因为内标基因。 在玉米转ZmsPLA2-2正义基因株系中，ZmsPLA2-2基因的表达强度是对照植株的1.7-5.33 倍;在玉米转ZmsPLA2-2反义基因株系中，ZmsPLA2-2基因的表达强度仅为对照植株的0.24-0.58倍。这表明在这些转基因株系中外源基因得到了有效的表达。
[0031]本发明