专利名称：一种鉴定大葱中与cms相关的线粒体基因的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因的分子标记，及该分子标记的制备方法和使用方法。
背景技术：
细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)属于母系遗传，不能产生可育花粉。目前已经在300多种植物中发现了细胞质雄性不育现象，并且广泛用于杂交制种。迄今为止，所报道的与CMS相关的基因大多数都位于线粒体基因组中，而且这些基因通常是发生重排，包括移位、插入与缺失。大葱(Allium fistulosum L.)是亚洲东部广泛栽培的重要蔬菜作物之一。张启沛等最早报道了国内大葱雄性不育(Zhang Q P, Wei YYj Zhang Q. 1987. Male sterility of welsh onion (Allium fistulosum L) in a natural population. Journal of ShandongAgricultural University，18，1-10. (in Chinese))。相关研究表明大葱雄性不育是由细胞质和核基因共同控制的(Mouse Tj Uehara T. 1985b. Inheritance of cytoplasmic malesterility in Allium fistulosum L. Journal of Japanese Society for HorticulturalScience，53:423-437)。由于大葱是两年生植物以及传统育种方法的复杂性，所以发展分子标记来辅助育种至关重要。目前，分子标记在葱属植物(如洋葱A.cepa，·、细香葱A. schoenoprasum、韭葱A. ampeloprasum)中已经取得较大进展。最初，育种工作者以线粒体基因作为探针，利用RFLP(restriction fragment length polymorphism)技术来鉴定细胞质类型(de Courcelet al. 1989;Holford et al. 1991;Havey 1993;Havey and Leite 1999;Engelka andTatlioglu2000)o虽然RFLP方法明显快于杂交育种，但是它仍然需要很长的时间来完成育种，这主要是因为从植株中分离出大量完整的DNA、用限制性内切酶消化DNA以及杂交都比较困难。因此，PCR (polymerase chain reaction)成为一个很好的选择，可以方便快速地区分单株植物的细胞质类型。Havey于1995年提出N型细胞质的叶绿体基因间隔区中存在IOObp的插入，因此在该类型的细胞质中扩增出了较大的片段(Havey MJ 1995Identification of cytoplasms using the polymerase chain reaction to aid inthe extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion.Theor Appl Genet，90:263 - 268) ; 1998 年 Sato Y 揭示了在 S 型细胞质 cob 基因的上游区域插入了一段叶绿体 DNA 序列(Sato Y. (1998). PCR amplification of CMS-specificmitochondrial nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes ofonion(Allium cepa L.). Theoretical and Applied Genetics，96，367-370);紧接着
Engelke等人于2002、2003年从细香葱中提出了一个新的PCR标记-orfA501 (Engelke
T，Tatlioglu T (2002)A PCR-marker for the CMSl inducing cytoplasm in chivesderived from recombination events affecting the mitochondrial gene atp9. TheorAppl Genet, 104:698 - 702 ；Engelke Tj Terefe D，Tatlioglu T. (2003)A PCR-basedmarker system monitoring CMS-(S), CMS-(T) and (N)-cytoplasm in the onion (Alliumcepa L. ). Theoretical and Applied Genetics, 107, 162-167) ；2009 年，Sunggil Kim等设计了一个依赖于ofr725及coxl的PCR分子标记，从而区分洋葱的三种细胞质类型(Sunggil Kim, Eul-Tai Lee, Dong Youn Cho, et al(2009)Identi Wcation of a novelchimeric gene, orf725, and its use in development of a molecular marker fordistinguishing among three cytoplasm types in onion (Allium cepa L.)Theor ApplGenet, 118:433 - 441)。然而，迄今为止国内外有关大葱雄性不育分子标记的研究报道还很少，盖树鹏等发展了一个SCAR标记和一个RAPD标记，用来区分大葱N型和S型细胞质(Gai S P, Meng X D(2010). Application of Molecular Markers Linking to CytoplasmicMale Sterile Loci to Assist Maintainer Line Selection and Their SelectionEfficiency in Welsh Onion(Allium fistulosum L.). Agricultural Sciences inChina, 9 (11) :1571-1576)。在该报道中，虽然RAH)标记可以鉴定多个品种的细胞质类型，但是由于其引物为随机引物，结果具有不稳定性d_SCAR标记SCS13虽然稳定可靠，但是只能鉴定4个大葱品种，具有一定的局限性。 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)是近年来发展起来的最有效的分子标记之一，它结合了 RFLP和RAPD技术并且克服了二者的不足之处(VosP, Hoigers R, Bleeker M, Reijans M, Van De Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, PelemanJ,Kuiper M(1995)AFLP: a new concept for DNA fingerprinting. Nucleic AcidsRes23:4407-4414)。然而，AFLP也存在着一些局限性，这主要是因为它费时费力，成本高，显性遗传。因此，育种工作者迫切地将AFLP标记转化成简单的PCR分子标记。序列特异性扩增区(Sequence-characterizedAmplified Region, SCAR)标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记是将目标RAPD片段进行克隆并对其末端测序，根据RAPD片段两端序列设计特异引物，对基因DNA片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记是共显性遗传，待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。已经报道的鉴定大葱细胞质类型的SCAR分子标记只有一个，即上文中的SCS13，但该标记检测的大葱品种有限，不能广泛地应用于多个品种大葱细胞质类型的检测中。因此，在科研和实践中，故需要一种适用品种广泛、检测结果稳定、操作简便易行的鉴定大葱中与CMS相关的线粒体基因的分子标记，用于辅助分子育种。
发明内容
本发明提供一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因的分子标记，及该分子标记的制备方法和使用方法；所述的与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因的分子标记的核昔酸序列如序列表中SEQNo I所不。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示。进一步地，用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3 所示。
一种重组表达载体、一种转基因细胞系、一种宿主菌，均含所述的与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因的分子标记。本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的制备方法，所述的的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示；该制备方法的步骤包括A、进行大葱线粒体基因组提取，得到大葱雄性不育系线粒体DNA CmtDNA)和大葱保持系线粒体DNA CmtDNA)；B、将所述的大葱雄性不育系线粒体DNA (mtDNA)和大葱保持系线粒体DNA(mtDNA)进行AFLP分析，得到与细胞质雄性不育相关的AFLP条带； C、将所述的与细胞质雄性不育相关的AFLP条带进行分离、回收、克隆、测序、分析，得到与细胞质雄性不育相关的AFLP标记；D、将所述的细胞质雄性不育相关的AFLP标记进行转化处理，得到细胞质雄性不育相关的SCAR分子标记，即为所述的与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因(mtDNA)的分子标记。本发明的目的是通过以下又一技术方案实现的一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的检测方法，所述的与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示；该检测方法的步骤包括A、提取被检测的大葱的总DNA ；B、以所述的被检测的大葱的总DNA作为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物；C、判断所述的扩增产物中是否存在所述的与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记。进一步地，B步骤中PCR扩增反应的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3 所示。进一步地，B步骤中PCR扩增反应的体系为20 μ 1，包括有10 XBuffer(含有Mg2+):
2μ I ；dNTPs 1. 6μ I ；核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示的分子标记的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No 2所不I U I ；核苷酸序列如SEQ No 1所示的分子标记的下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No 3 所示1μ I ；Taq 酶0. 2 μ I ;模板2 μ I ；ddH20 :补至 20 μ I。进一步地，B步骤中PCR扩增反应的程序为第一步94°C,预变性5min ;第二步94°C，变性30s ;第三步50°C，退火45s ;第四步72°C延伸90s，第二步至第四步共40个循环；第五步，72°C，最后延伸IOmin ;第六步4°C保存。本发明相比现有技术具有以下有益效果I、本发明将大葱中与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因的AFLP分子标记转化为SCAR分子标记，所以可以快速检测大量样品，结果稳定性好，重现性高，操作简便。
2、本发明中的SCAR标记可以检测该实验的所有品种，即8个不育系品种、8保持系品种以及4个杂交品种，该标记适用范围广泛，可以方便地鉴定大葱细胞质类型，辅助分子育种的发展。
图I为实施例I中大葱样本AFLP分析聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2为实施例I中片段kl与k2的核苷酸序列比对图。图3为实施例I中大葱样本的SCAR标记检测电泳图。图4为实施例2中被检测大葱的SCAR标记检测电泳图。
具体实施例方式实施例I :本实施例为一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因的分子标记及其制备方法。一种鉴定大葱中与CMS相关的线粒体基因的分子标记，所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记的核昔酸序列如序列表中SEQ No 1所不。用于扩增所述的与CMS相关的线粒体基因分子标记的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3所示。—种重组表达载体、一种转基因细胞系、一种宿主菌，均含所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记。一种鉴定大葱中与CMS相关的线粒体基因的分子标记的制备方法，所述的与CMS相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ No 1所示；该制备方法的步骤包括A、大葱线粒体基因组提取选取大葱不育系和大葱保持系，采用蔗糖沉淀差速离心法分别进行mtDNA提取处理，得到大葱雄性不育系mtDNA和大葱保持系mtDNA ；所述的mtDNA提取处理的步骤为a.从上述品种的大葱中取新鲜的葱白30_80g，优选为50g ；b.向上述的葱白中加入五倍的预冷的缓冲液A (O. 5mol/L鹿糖、50mmol/LTris-Cl、20mmol/L EDTA.O. I % BSAUOmmo 1/L巯基乙醇，pH 8. O)，再用榨汁机破碎组织，纱布过滤，得到滤液，再分装到50ml的离心管中；c.将所述的滤液进行离心处理，离心力为1500g，时间为lOmin，取上清液a ；d.将所述的上清液a进行离心处理，离心力为2600g，时间为lOmin，取上清b ；e.将所述的上清液b进行离心处理，离心力为13000g，时间为15min，弃上清，得到粗线粒体沉淀；f.向所述的粗线粒体沉淀中加入预冷的IOml缓冲液B(0. 5mol/L鹿糖、50mmol/LTris-Cl, pH7. 5)，悬浮沉淀后进行离心处理，离心力为800g，时间为lOmin，得到上清c ；g.在所述的上清c中加入500 μ I IM的MgCl和I. 5 μ I DNaseI，冰浴2h，EDTA终
止反应，得到反应液；h.将所述的反应液小心地转入盛有25ml缓冲液C(0. 6mol/L鹿糖、10mmol/LTris-Cl>20mmol/LEDTA)的离心管中，进行离心处理,离心力为13000g,时间为20min,收集沉淀即为较纯的线粒体；i.将所述的较纯的线粒体进行裂解处理，DNA提取处理，得到大葱mtDNA ；所述的大葱mtDNA分为大葱雄性不育系mtDNA和大葱保持系mtDNA。本实施例的大葱样本为所述的大葱雄性不育系(4-6Α、64Α、58Α1、58Α2、23-24Α)及相应的大葱保持系(1_3B、63B、57B、19-22B)，由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供。B、将所述的大葱雄性不育系mtDNA和大葱保持系mtDNA进行AFLP分析，得到与CMS相关的AFLP条带；a.将所述的不育系mtDNA和大葱保持系mtDNA选用EcoRI/Msel进行酶切处理，得到酶切产物，然后与相应的接头进行连接处理，得到连接产物；
所述的酶切处理和连接处理在同一反应体系中进行；该反应体系为20 μ 1，包括有11 μ I ddH20, 2 μ I IOxNBE Buffer2, 0. 4 μ I ATP (IOmM) , 0. 4 μ I EcoRI 接头，O. 4 μ IMseI 接头，O.25 μ I EcoRI(10U/μ I), O. 25 μ I MseI(10U/μ I), O. 2 μ 1T4DNA Iigase(400υ/μ 1)，0· 1μ I IOOxBSA, 5 μ I DNA模版(5μ I总共达到250ng);该反应体系的反应程序为先于37°C进行酶切处理5h，再于16°C进行连接6h，得到连接产物；b.将所述的连接产物进行预扩增反应，得到预扩增产物；所述的预扩增选用的引物为两条末端各有I个选择性核苷酸，上游引物3-GTAGACTGCGTACCAATTCA-5，下游引物3-GACGATGAGTCCTGAGTAAC-5；该预扩增反应体系为20 μ 1，包括有5 μ I连接产物，2 μ I IOxBufer,I. 6 μ ldNTPs, I. 2μ I Mg2+, 0. 6 μ I ΕΑ00, 0. 6 μ I MC00,0. 2μ I Taq 酶，8·8μ1 ddH20 ；所述的预扩增反应的程序为72°C预变性2min ;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，共29个循环；72°C最后延伸IOmin ;4°C保存；c.将所述的预扩增产物进行扩增反应，得到扩增产物；所述的扩增反应选用的引物为两个末端各含有3个选择性核苷酸(EANN和MCNN)，共有256对；以上的256对引物由以下A组、B组各16条核苷酸序列全排列而成
权利要求
1.一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记，其特征在于所述分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示。
2.根据权利要求I所述的分子标记，其特征在于用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3所示。
3.—种重组表达载体，其特征在于含有权利要求I中所述的分子标记。
4.ー种转基因细胞系，其特征在于含有权利要求I中所述的分子标记。
5.一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的制备方法，其特征在于所述的的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示； 该制备方法的步骤包括 A、进行大葱线粒体基因组提取，得到大葱雄性不育系线粒体DNA和大葱保持系线粒体DNA ； B、将所述的大葱雄性不育系线粒体DNA和大葱保持系线粒体DNA进行AFLP分析，得到与细胞质雄性不育相关的AFLP条带； C、将所述的与细胞质雄性不育相关的AFLP条带进行分离、回收、克隆、测序、分析，得到与细胞质雄性不育相关的AFLP标记； D、将所述的细胞质雄性不育相关的AFLP标记进行转化处理，得到细胞质雄性不育相关的SCAR分子标记，即为所述的与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记。
6.一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的检测方法，其特征在于所述的与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ No I 所示； 该检测方法的步骤包括 A、提取被检测的大葱的总DNA； B、以所述的被检测的大葱的总DNA作为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物； C、判断所述的扩增产物中是否存在所述的与细胞质雄性不育相关的线粒体基因的分子标记。
7.根据权利要求6所述的分子标记的检测方法，其特征在于 B步骤中PCR扩增反应的引物的核苷酸序列如序列表中SEQ No 2和SEQ No 3所示。
8.根据权利要求6或7所述的分子标记的检测方法，其特征在于 B步骤中PCR扩增反应的体系为20 μ 1，包括有IOXBuffer (含有 Mg2+) 2μ I ；dNTPs 1. 6μ I ； 核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示的分子标记的上游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No :2所示1μ I ； 核苷酸序列如序列表中SEQ No 1所示的分子标记的下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ No :2所示1μ I ；Taq 酶0· 2 μ I ; 模板2μ I ; ddH20 :补至 20 μ I0
9.根据权利要求8所述的分子标记的检测方法，其特征在于B步骤中PCR扩增反应的程序为第一歩94°C，预变性5min ;第ニ步94°C，变性30s ；第三步50°C，退火45s ;第四步72°C延伸90s，第二步至第四步共40个循环；第五歩，72°C，最后延伸IOmin ;第 六步4°C保存。
全文摘要
本发明提供一种鉴定大葱中与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因的分子标记，及该分子标记的制备方法和使用方法；所述的与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因的分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQNo1所示；用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如序列表中SEQNo2和SEQ No3所示。本发明将大葱中与细胞质雄性不育(CMS)相关的线粒体基因的AFLP分子标记转化为SCAR分子标记，所以可以快速检测大量样品，结果稳定性好，重现性高，操作简便；本发明中的SCAR标记可以检测该实验的所有品种，即8个不育系品种、8保持系品种以及4个杂交品种，该标记适用范围广泛，可以方便地鉴定大葱细胞质类型，辅助分子育种的发展。
文档编号C12N1/15GK102839220SQ201210365130
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者王永勤, 王婵, 李洪有 申请人:北京市农林科学院