专利名称：一种酵母麦角固醇高产菌株及其选育方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于发酵工 程和微生物菌种选育的技术领域，特别涉及一种酵母麦角固醇高产菌株及其选育方法与应用。
背景技术：
麦角固醇是一种重要医药化工原料，可用于制造VD2、激素黄体酮、可的松，在临床上能有效防治婴幼儿维生素D缺乏性佝偻病，其对骨折、骨结核、龋齿等病症也有较好的预防和治疗作用。由于留体化合物分子中含有不对称的中心，化学合成步骤多、产率低、成本高，难于工业化生产，目前国内外主要采用微生物发酵法生产。麦角固醇主要存在于植物和一些真菌的细胞膜上。其中以酵母菌的含量最高，所以一般都以酵母作为麦角固醇的生产菌株。麦角固醇是酵母细胞固醇类中最主要的一种化合物，由于其独特的化学结构，能增加细胞膜的坚固性。当有机溶剂存在的情况下对细胞进行伤害时，在应激条件的作用下，细胞合成更多的麦角固醇使细胞膜具有更好的稳定性，形成障碍物阻止有机溶剂进入细胞造成伤害。有研究表明，与酒精敏感的工业酵母菌株相比，耐高浓度乙醇的酵母菌株在有氧分批培养过程中能合成较多的留醇和脂类物质，而且在高浓度酒精的伤害中，耐受性强的酵母菌株死亡速率明显要比敏感型酵母菌株慢，这说明酵母细胞膜上留醇和脂类物质的含量与生产菌株耐有机溶液浓度的能力密切相关。对生活条件的变化有迅速的适应能力，是微生物生长的一大特点。外界环境的变化，能使微生物群体特性发生相应的变异。在有机溶剂存在的条件下，微生物细胞可采用多种方式去适应这种不利的环境，主要包括细胞膜本身的成分特点及相应的组成的改变如细胞膜通透性增加、长链不饱和脂肪酸含量的增加、磷脂组成中磷酸乙醇胺(PE)、磷酸肌醇(PI)含量增加、胆固醇及麦角固醇含量增加、冲击蛋白的合成、线粒体活性增强、海藻糖含量提高、质膜ATP酶活性增强等等，且这些因素间又相互影响，因此，细胞对有机溶剂的适应机制是一个相当复杂的反应体系。其中起着最主要作用的是细胞膜自身通透性和固醇、脂类的含量。长时间不间断地利用强极性、高浓度有机溶剂对酵母生产菌株进行应激定向驯化，改变生产菌株的生理性状，提高其对有机溶剂毒害的抗性和耐受性，从而筛选出高产酵母麦角固醇的生产菌株，不失为是一种筛选改良菌种有效的技术手段。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种酵母麦角固醇高产菌株。本发明的另一目的在于提供所述的酵母麦角固醇高产菌株的选育方法。本发明的再一目的在于提供所述的酵母麦角固醇高产菌株的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种酵母麦角固醇高产菌株，名称为酿酒酵母 scut_B6305 (Saccharomyces cerevisiae scut_B6305),保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC N0:M2012105 ；所述的酵母麦角固醇高产菌株的细胞形态为椭圆形或卵圆形，直径大小为10 20 μ m ;菌落形态较大而厚,呈圆形、隆起,湿润,较光滑,颜色为淡黄白色；所述的酵母麦角固醇高产菌株的选育方法，包含以下步骤(I)高极性有机溶剂耐受性酵母菌株的初步筛选将酿酒酵母出发菌株接入种子培养基中，28°C培养18 24h后按体积百分比10%转接入发酵培养基中，28°C培养24h后加入二甲基亚砜，二甲基亚砜的终浓度为体积百分比12%，强制应激处置6小时，于摇床上震荡培养后涂布固体培养基平板；待长出菌落后，挑选长势好、菌落大的菌落再次接入种子培养基，进行再一轮筛选；其中，二甲基亚砜的起始浓度为体积百分比12%，每轮筛选二甲基亚砜浓度比上一轮浓度提高体积百分比I. 0%，直至培养基平板上菌落形成率只能形成几个菌落；(2)强极性有机溶剂置措耐受性酵母富集驯化和平板分离复筛将初筛获得的耐受性菌株接入种子培养基中，28°C培养18 24h后按体积百分比10. 0%转接入发酵培养基中，28°C培养24h后加入二甲基亚砜，浓度为步骤(I)所用的二甲基亚砜的最高浓度，于摇床上震荡培养后涂布固体培养基平板，挑选长势最好的菌落进行下一代驯化；经过五代的按步骤(I)所使用的最高浓度的二甲基亚砜置措驯化培养，得到酵母麦角固醇高产菌株。所述的种子培养基的组成为每13g麦芽汁培养基加水lOOmL，pH自然；所述的发酵培养基的组成为每13g麦芽汁培养基加水lOOmL，pH自然；所述的固体培养基的组成为每13g麦芽汁培养基加水IOOmL,琼脂2g, pH自然；步骤(I)中所述的出发菌种优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2. 599 ； 所述的酵母麦角固醇高产菌株用于生产麦角固醇。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明提供的酵母麦角固醇高产菌株，其单位细胞麦角固醇含量达到5. 63mg/g (干重)，比出发菌株提高了 30. 32% ;其单位体积发酵液的生产能力为90. 8mg/100mL，是出发菌株的I. 91倍。(2)本发明提供的选育方法培育条件温和、操作简单、投入少、易掌握。
图I是酿酒酵母scut_B6305的细胞与菌落形态图；其中，图(a)为放大1000倍的油镜观察图；图(13)是菌落图。图2是皂化-萃取-紫外检测法测定酵母麦角固醇的标准曲线。图3是二甲基亚砜耐受性酵母菌株驯化过程中麦角固醇积累情况图。图4是高耐受性酵母菌株在不同驯化过程中麦角固醇生产能力的比较图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限·于此。
实施例I(I)高极性有机溶剂耐受性酵母菌株的初步筛选将出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, AS2. 599,购自中国科学院微生物研究所)接入种子培养基(每13g麦芽汁培养基加水lOOmL，pH自然，下同)中，28°C培养18 24h后按体积百分比10%转接入发酵培养基(每13g麦芽汁培养基加水lOOmL，pH自然，下同)中，28°C培养24h后吸取I. OmL菌悬液至I. 5mL无菌的小离心管中,加入二甲基亚砜，二甲基亚砜的终浓度为体积百分比12%，强制应激处置6小时，于摇床上震荡培养后涂布固体培养基(每13g麦芽汁培养基加水lOOmL，琼脂2g，pH自然，下同)平板。待长出菌落后，挑选长势好、菌落大的菌落再次接入种子培养基，进行再一轮筛选。其中，二甲基亚砜的起始浓度为体积百分比12%，每轮筛选二甲基亚砜浓度比上一轮浓度提高1.0%，直至培养基平板上菌落形成率很低，只能形成少数几个菌落，通过初筛最终获得了二甲基亚砜耐受性菌株DM-c和DM-d。 (2)强极性有机溶剂置措耐受性酵母富集驯化和平板分离复筛以初筛的最高有机溶剂浓度(二甲基亚砜浓度为体积百分比18. 0%)对初筛所得菌株进行富集驯化培养。将初筛获得的耐受性菌株接入种子培养基中，28°C培养18 24h后按体积百分比10. 0%转接入发酵培养基中，28°C培养24h后吸取I. OmL菌悬液至I. 5mL无菌的小离心管中，加入初筛确定的最高浓度为体积百分比18. 0%的二甲基亚砜，于摇床上震荡培养后涂布固体培养基平板，挑选长势最好的菌落进行下一代驯化。经过五代的体积百分比18. 0% 二甲基亚砜置措驯化培养，最终筛选出遗传性能稳定的二甲基亚砜高耐受性菌株scut-B6305，细胞形态为椭圆形或卵圆形，直径大小为10 20 μ m左右，如图I (a)所示；菌落形态较大而厚，呈圆形、隆起，湿润，较光滑，颜色为淡黄白色，如图I (b)所示。(3)有机溶剂置措高耐受性酵母菌株产麦角固醇能力的测定从复筛驯化获得的二甲基亚砜高耐受性菌株Scut-B6305接入种子培养基中，28°C培养18 24h后按体积百分比10. 0%量转接入IOOmL发酵培养基中，28°C培养48h，然后取样进行生物量(见测定方法II)和麦角固醇含量的测定。I、麦角固醇含量的测定，为皂化-萃取-紫外检测法①麦角固醇标准曲线测定精确称取麦角固醇标准品12. 2mg，用无水乙醚稀释定容至IOOmL,振荡均匀。分别吸取0. 5mL、l. OmLU. 5mL、2. OmL,2. 5mL稀释液，各加适量无水乙醚定容至10mL。测定各试样溶液在282nm处的紫外吸光度，以吸光度为纵坐标、麦角固醇浓度为横坐标，绘制麦角固醇标准曲线，如图2所示。②取发酵液8. OmL, 5000r/min离心IOmin,弃上清液,沉淀用蒸懼水离心洗漆3次后，转置250mL三角瓶中，加入质量百分比30%的氢氧化钾溶液20mL和质量百分比95%的乙醇12mL，沸水浴中皂化I. 5h ;再次加入质量百分比95%的乙醇4mL，皂化lh。冷却至室温后，加乙醚50mL，剧烈震荡15min，静止2h，分层，取上层萃取液ImL至IOmL容量瓶定容，于波长282nm测定吸光度。参照同样波长下所作标准曲线，即可知麦角固醇浓度。单位干重细胞麦角固醇含量按下式计算麦角固醇含量(％)=CXV/WX 100%式中C一试样中麦角固醇浓度(mg · mL-1)(由标准曲线查得)；V—萃取溶剂体积(mL) ;W—酵母菌的生物量(mg)。
单位体积发酵液麦角固醇的生产能力(mg/100mL) =IOOmL发酵液中所含的细胞生物量(mg) X干菌体细胞中的麦角固醇含量(％)。II、生物量测定方法为取发酵液10. OmL于15. OmL塑料离心管中，5000r/min离心lOmin，弃上清液，用蒸馏水离心洗涤沉淀3次，然后用已烘干称重的滤纸片过滤，所得酵母菌体于60°C烘箱过夜至恒重，称重，换算成每IOOmL发酵液的菌体量，即为细胞生物量(mg/ IOOmDo结果如图3和4所示随着二甲基亚砜置措胁迫驯化次数的增加，酵母菌株对二甲基亚砜的耐受性有所提高，细胞中麦角固醇含量也呈逐渐上升趋势。所获得的高耐受性酿酒酵母菌株scut-B6305的麦角固醇含量达到5. 63mg/g(干重)，比出发菌株的的含量提高了30. 32%。而在经过五次的重复驯化后，耐受性菌株酿酒酵母scut-B6305的生物量得到了较大程度的恢复，其最大细胞生物量可达到I. 61g/100mL (干重)，单位体积发酵液的生产能力可达到 90. 8mg/6,是出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, AS2. 599)的 I. 91 倍，都极大地提高了菌株的生产能力。将该菌株命名为酿酒酵母scut_B6305 (Saccharomyces cerevisiae scut_B6305),保藏在位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2012 年 4 月 10 日，保藏编号为 CCTCC N0:M2012105。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种酵母麦角固醇高产菌株，其特征在于名称为酿酒酵母SCUt-B6305(Saccharomyces cerevisiae scut_B6305),保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC N0:M2012105。
2.权利要求I所述的酵母麦角固醇高产菌株的选育方法，其特征在于包含以下步骤 (O高极性有机溶剂耐受性酵母菌株的初步筛选 将酿酒酵母出发菌株接入种子培养基中，28°C培养18 24h后按体积百分比10%转接入发酵培养基中，28°C培养24h后加入二甲基亚砜，二甲基亚砜的终浓度为体积百分比12%，强制应激处置6小时，于摇床上震荡培养后涂布固体培养基平板；待长出菌落后，挑选长势好、菌落大的菌落再次接入种子培养基，进行再一轮筛选；其中，二甲基亚砜的起始浓度为体积百分比12%，每轮筛选二甲基亚砜浓度比上一轮浓度提高体积百分比1.0%，直至培养基平板上菌落形成率只能形成几个菌落； (2)强极性有机溶剂置措耐受性酵母富集驯化和平板分离复筛 将初筛获得的耐受性菌株接入种子培养基中，28 °C培养18 24h后按体积百分比10. 0%转接入发酵培养基中，28°C培养24h后加入二甲基亚砜，浓度为步骤(I)所用的二甲基亚砜的最高浓度，于摇床上震荡培养后涂布固体培养基平板，挑选长势最好的菌落进行下一代驯化；经过五代的按步骤(I)所使用的最高浓度的二甲基亚砜置措驯化培养，得到酵母麦角固醇高产菌株。
3.根据权利要求2所述的酵母麦角固醇高产菌株的选育方法，其特征在于所述的种子培养基的组成为每13g麦芽汁培养基加水lOOmL，pH自然。
4.根据权利要求2所述的酵母麦角固醇高产菌株的选育方法，其特征在于所述的发酵培养基的组成为每13g麦芽汁培养基加水lOOmL，pH自然。
5.根据权利要求2所述的酵母麦角固醇高产菌株的选育方法，其特征在于所述的固体培养基的组成为每13g麦芽汁培养基加水IOOmL,琼脂2g，pH自然。
6.权利要求I所述的酵母麦角固醇高产菌株在生产麦角固醇中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种酵母麦角固醇高产菌株及其选育方法与应用。该酵母麦角固醇高产菌株的名称为酿酒酵母scut-B6305，保藏于位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年4月10日，保藏编号为CCTCC NO:M2012105。本发明通过长时间不间断地利用二甲基亚砜对酵母生产菌株进行应激定向驯化，选育出该酵母麦角固醇高产菌株。该酵母麦角固醇高产菌株的单位细胞麦角固醇含量达到5.63mg/g，比出发菌株提高了30.32%；其单位体积发酵液的生产能力为90.8mg/100mL，是出发菌株的1.91倍，可用于生产中获得麦角固醇。
文档编号C12R1/865GK102911883SQ20121036470
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者张毅, 林晓珊, 何小妮, 陈子健 申请人:华南理工大学