专利名称:一株有机溶剂耐受型假单胞菌及其在降解多环芳烃中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域：
的假单胞菌及其应用，尤其涉及的是一种一株有机溶剂耐受型假单胞菌及其在降解多环芳烃中的应用。
背景技术：
近年来，随着工农业生产的迅速发展，全球土壤，水分以及大气的污染程度越来越严重。环境污染已经成为当今世界各国普遍关注的热点问题。在各类污染物中，多环芳烃 (polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)类化合物分布广泛，危害最为严重。环境中的 PAHs主要来源于石油泄漏，以及煤、石油、木材、有机高分子化合物的不完全燃烧。PAHs稳定性强，生物富集率高，潜在毒性大，具有致畸、致癌和致突变等作用。在总数已达1，000多种的环境致癌物中，PAHs占了三分之一以上，为数量最多的一类。美国环保局(EPA)在上世纪80年代就将16种PAHs列入了优先控制的环境污染物黑名单，我国也已经把PAHs列入环境污染的黑名单。消减PAHs污染对于改善人类生存环境，提高人类生活质量具有重大意义。由于PAHs非常顽固，自然条件下很难通过温和的化学作用降解，PAHs除了很少一部分发生光化学分解之外，绝大部分都是通过生物降解途径从环境中慢慢消失。因此，利用微生物降解作用加速PAHs转化为无害物质的过程被认为是修复PAHs污染环境的最佳途径。目前，人们通过富集培养已经分离出许多PAHs降解菌株。但是，对于实际石油污染环境下的 PAHs降解，微生物面临复杂的生存压力，特别是石油成份作为有机溶剂对细胞的毒性作用。 对微生物的生理研究证明有机溶剂的毒性和它们的油水分配系数(log P。w)_溶剂在辛醇和水相中的分配系数的对数值有关。溶剂的极性越大，log 值就越小，溶剂毒性也越大。一般认为，log P。w值在1 5之间的有机溶剂在水层(细胞存在于水层)的分配比例较高， 进入细胞膜脂双层的溶剂含量高，所以对细胞产生的毒性极大。石油污染物大部分为脂溶的疏水性有机物，能破坏细胞膜，危害细胞的结构和功能完整性，导致细胞的破裂死亡。因此，迫切需要寻找能够耐受有机溶剂的PAHs降解菌株用于增强石油污染环境的修复。
有机溶剂耐受菌是一类新的能与有害影响因素竞争并能在高浓度有机溶剂中茁壮生长的微生物。一般来说，由于有机溶剂对细菌有毒性，所以一直以来人们都认为细菌不能在有机溶剂环境中生存。1989年，Inoue等关于溶剂耐受性微生物的报道改变了人们对微生物生存能力的认识，自此各国研究者陆续分离出多种有机溶剂耐受微生物，并发现了微生物对有机溶剂产生抗性的多种机理，如有机溶剂输出泵、快速修复膜、降低膜透性、增加膜严密度和降低细胞表面疏水性等，能使细菌设法避开有害因素。
现有技术文献已经有关于能够以毒性有机溶剂苯乙烯为碳源生长菌株的研究，也有报道通过基因工程改造之后，中国专利号200610044410. 1 ；公开号为1861785 ；名称为一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌及其在双液相反应中的应用。该技术公开了一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌，该菌株于2006年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为No.M 206011。本发明还公开了所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用，其方法包括(1)菌株选择，( 种子细胞培养，( 制备催化剂细胞，(4)收集催化剂细胞，( 休止细胞制备，(6)在双液相反应中处理样品，(7)样品检测；该菌株具有很强的耐受有机溶剂的能力，且具有较高的降解二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩的能力。有机溶剂耐受菌株也能够转化毒性有机溶剂甲苯以及进行生物脱硫，然而，有机溶剂耐受菌株对于PAHs的降解未见报道。在石油以及一些工业污染的环境中，有机溶剂往往伴随着多环芳烃共同存在于污染体系中，大部分细菌能够通过细胞结构的改变抵抗低浓度、毒性相对较低的有机溶剂。但是一些毒性极强log卩 值为1 5的有机溶剂，例如苯及其烷基衍生物即使在极低的浓度下(0. )也极易导致细胞的死亡。因此，获得具有能在毒性有机溶剂存在条件下生长的PAHs降解菌株用于污染环境修复具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对目前存在的降解多环芳烃的难题和现实的迫切需求，本发明提供了一株有机溶剂耐受型假单胞菌及其在降解多环芳烃中的应用。
本发明所述的有机溶剂耐受型假单胞菌，该菌名为假单胞菌(I^eudomonas sp.) B6-3，已于2010年4月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏登记号为 CGMCCN0. 3758。
所述的假单胞菌O^seudomonas sp. )B6_3，来源于化工厂被PAHs污染的土壤，经
富集培养、分离得到。
所述的假单胞菌(Pseudomonas sp. ) B6-3，该菌株菌落呈亮白色、圆形、边缘整齐、 光滑湿润，该菌株为革兰氏阴性，杆状，端部有鞭毛，具有过氧化物酶、乙醇脱氢酶、氧化酶活性，不能产生硝化反应，无尿素酶、明胶水解酶的活性。该菌株的脂肪酸类型与荧光假单胞菌 A 型(Pseudomonas fluorescens biotype A)的相似度最高,为 0. 957。
本发明所述的有机溶剂耐受型假单胞菌(Pseudomonas sp. )B6_3在降解多环芳烃中的应用，所述假单胞菌O^eudomonas sp.)B6-3在无机盐培养基中利用联苯为唯一碳源生长后能够同时降解含有芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)茈、茚并(l，2，3-cd)芘的多环芳烃混合物。
其中，上述假单胞菌(Pseudomonas sp. )B6_3富集培养所用培养基为无机盐培养基。所述无机盐培养基的配方是每1，OOOrnl去离子水中含有K2HPO4 ·3Η20 5. 2g ； ΚΗ2Ρ043· 7g ；Na2SO4L Og ；MgSO4 · 7h20 0. 2g ；NH4Cl 2. Og ；微量金属盐溶液 Iml ；其中， 所述微量金属盐溶液配方为1000ml去离子水中含有!^eCl2 · 4H20 0. 3g, CoCl2 · 6H20 0. 038g，MnCl2 · 4H20 0. 02g, ZnCl2 0. 014g, H3BO3 0. 0124g, Na2MoO4 ‘ 2H20 0. 04g, CuCl2 · 2H200. 0034g。
其中，所述无机盐培养基中加入的唯一碳源是联苯，其浓度为2. 4g/L。富集培养、 分离菌株时加入联苯固体5g/L。
其中，所述假单胞菌(I^eudomonas sp. )B6_3的培养温度优选为30°C，培养摇床转速优选为200rpm。
本发明提供的假单胞菌(I^eudomonas sp. )B6_3能够以联苯为唯一碳源生长，能够耐受有机溶剂，并且能够降解13种EPA规定优先控制PAHs混合物。
本发明所提供的菌株假单胞菌(I^eudomonas sp. )B6_3能够利用联苯为唯一碳源生长，将联苯矿化为ω2和H20。在纯培养条件下，该菌株能在20h内将无机盐培养基中 2. 4g/L的联苯降解90%以上，菌液的浊度由OD620为0. 14增加到最大值2. 06。
本发明所提供的菌株假单胞菌(I^eudomonas sp. ) B6-3能够耐受log P。w值为2. 5 体积比为20%的有机溶剂甲苯OO%为甲苯和LB培养基体积比)，在体积比高达100% (有机溶剂和LB培养基的体积比)的对二甲苯(log P。w*3. 1)中能够生长良好。添加体积比 1 4%的柴油能够促进假单胞菌B6-3在无机盐培养基中利用联苯生长，更高浓度的柴油只是略微抑制假单胞菌B6-3的生长。
所述的LB培养基的配方为每1，OOOml去离子水中含有酵母膏5g ；蛋白胨5g ； NaCllOg ；用NaOH溶液调pH值为7. 0。
本发明所提供的菌株假单胞菌(I^eudomonas sp. )B6_3在无机盐培养基中利用联苯为唯一碳源生长后能够同时降解13种美国国家环保局(EPA)公布的优先消减的多环芳烃混合物，包括芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a) 芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)茈、茚并(l，2，3-cd)芘。利用OD62tl为5.0的细胞悬液，5 天内，芴和蒽的降解率达到100%，同时，上述其它多环芳烃的降解率介于48. 8%到76. 8% 之间。在石油以及一些工业有机物污染的环境中，有机溶剂往往伴随着PAHs共同存在于污染体系中，以往报道的PAHs降解菌株在这种有机溶剂毒性的环境下很难存活，往往达不到修复PAHs污染的效果。本发明与现有的PAHs降解菌株相比，具有耐受有机溶剂的特点，这对于PAHs降解菌株在环境修复中的实际应用更具优势。
图1为假单胞菌(I^eudomonas sp. )B6_2脂肪酸分析的气相色谱图；
其中图中各个峰对应的脂肪酸标注在表1中。
表1 图1中各个峰对应脂肪酸的鉴定、分析结果
保留时间(min)脂肪酸名称相对含量(％)1. 621Solvent peak3. 13110:10. 124. 22610:030H3. 264. 76112:02. 675. 324unknown0. 076. 16212:020H4. 106. 54412:030H3. 86
5
权利要求
1.一株有机溶剂耐受型假单胞菌，其特征在于，该菌名为假单胞菌I3Seudomonas sp. B6-3, 已于2010年4月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏登记号为CGMCC NO. 3758。
2.一种如权利要求
1所述假单胞菌在降解多环芳烃中的应用。
3.根据权利要求
2所述的应用，其特征是，所述假单胞菌(Pseudomonassp.)B6_3在无机盐培养基中利用联苯为唯一碳源生长后能够同时降解含有芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a) 蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)茈、茚并 (1,2,3-cd)芘的多环芳烃混合物。
4.根据权利要求
3所述的应用，其特征是，所述假单胞菌(Pseudomonassp.)B6_3的培养温度为30°C，培养摇床转速为200rpm。
5.根据权利要求
3所述的应用，其特征是，所述无机盐培养基的配方是每1，OOOml去离子水中含有 I^2HPO4 · 3H20 5. 2g ；ΚΗ2Ρ043· 7g ；Na2SO4L Og ；MgSO4 · 7H20 0. 2g ；NH4C12. Og ； 微量金属盐溶液Iml ；其中，所述微量金属盐溶液配方为1000ml去离子水中含有 FeCl2 · 4H20 0. 3g, CoCl2 · 6Η200· 038g, MnCl2 · 4H20 0. 02g, ZnCl2O. 014g, H3BO3O. 0124g, Na2MoO4 · 2H200. 04g, CuCl2 · 2H20 0. 0034g。
6.根据权利要求
3所述的应用，其特征是，所述唯一碳源联苯的浓度为2.4g/L。
专利摘要
本发明公开了一株有机溶剂耐受型假单胞菌，该菌名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3，已于2010年4月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏登记号为CGMCC NO.3758。本发明还公开了所述假单胞菌在降解多环芳烃中的应用。本发明的假单胞菌B6-3具有很强的有机溶剂耐受能力，可耐受log Pow在2.5-5.6之间的高毒性有机溶剂，可在有机溶剂的胁迫下利用联苯为唯一碳源生长；能够降解13种美国国家环保局(EPA)规定优先消减的多环芳烃(PAHs)。本发明的假单胞菌B6-3在有机溶剂和多环芳烃共存的极端污染环境的修复处理方面具有很大的应用前景。
文档编号C12N1/20GKCN101955896 B发布类型授权 专利申请号CN 201010203344
公开日2012年2月1日 申请日期2010年6月18日
发明者唐鸿志, 李庆刚, 殷光波, 王晓玉, 许平, 陶飞, 马翠卿 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),