水稻基因OsIAGT1及其编码的糖基转移酶在催化合成生长素糖酯中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻基因OsIAGT1的序列及其编码的糖基转移酶在催化合成生长素糖酯中的应用；其中所述糖基转移酶基因OsIAGT1的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其编码的糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。所述生长素是吲哚乙酸、吲哚丁酸、吲哚丙酸、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸。将糖基转移酶OsIAGT1与所述生长素任一种放于反应管中进行酶促反应，即可催化合成相应的生长素糖酯。本发明的公开为利用一种新的酶高效、专一性地合成这些生长素物质的糖酯提供了可行的方法，本发明实施后将为生长素糖酯合成工业带来巨大经济效益。
【专利说明】水稻基因OsIAGTI及其编码的糖基转移酶在催化合成生长
素糖酯中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种糖基转移酶基因的序列及其应用，尤其涉及一种水稻糖基转移酶基因OsIAGTI的序列及其编码的糖基转移酶在催化合成生长素糖酯中的应用；属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]生长素是第一个被发现的植物激素，它调控植物的生长发育的各个方面。不论是人工合成的生长素类似物如2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)等还是天然存在的生长素如吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)都被广泛应用于科研和农业生产中，它们的共同特点是都含有一个羧基基团(-C00H)。在植物体内，该羧基可与葡萄糖以共价键结合，从而形成生长素的糖酯。生长素的糖酯被认为是生长素的失活形式和贮藏形式(Bartel，1997)。目前，生长素的糖酯常作为标准品被用在生长素糖基化修饰等科学研究中。在化学和生物技术产业，获得生长素糖酯的途径主要是从植物中提取或化学合成。由于植物体内生长素糖酯的含量很低，提取量非常有限，纯度难以保证，并且提取过程复杂。如果用化学方法合成，也有过程复杂、成本高、环境污染等缺点。相比之下，生物酶法合成生长素糖酯化合物则具有效率闻、成本低、环境清洁等优点。
[0003]植物体内有一类酶，被称为糖基转移酶，它们专门负责植物体众多化合物的糖基化修饰，它将活化的糖连接到不同的受体分子上，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子等，形成糖苷键。糖基化是一种普遍的生理现象，是植物细胞维持代谢平衡的主要机制之一，在维持植物正常生长发育、应对环境压力等方面具有重要的作用(Lim et al,2004;王军等，2009)。到目前为止，生物界存在的糖基转移酶按照催化的底物性质和序列相关性可以分为94个家族。其中家族I (GTl)的酶所催化的底物是一些亲脂性的小分子化合物，在其-0H、-C00H、-NH2、-SH或C-C基团上能催化结合上一个或多个糖基(Bowles et al.2005)。
[0004]水稻是一种单子叶植物，也是重要的粮食作物。随着水稻全基因组测序完成，水稻基因克隆和基因功能的研究得到了快速发展。本申请是在研究水稻基因功能的基础上提出了一种水稻糖基转移酶基因OsIAGTI的序列及其应用，即OsIAGTI基因序列及其编码的糖基转移酶OsIAGTI的应用。该基因来自于水稻，在大肠杆菌中可以指导合成糖基转移酶OsIAGTl。我们发现这种酶在试管中能够催化多种生长素类化合物形成糖酯。经过检索，目前尚未发现来自水稻的基因序列及编码的糖基转移酶在催化合成生长素糖酯中的应用的报道。
【发明内容】
[0005](1)本发明的目的
[0006]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种水稻糖基转移酶基因OsIAGTI的序列及其编码的糖基转移酶OsIAGTl在催化合成生长素糖酯中的应用。[0007](2)实现本发明的具体技术方案
[0008]本发明所述水稻糖基转移酶基因OsIAGTl，其特征在于:所述水稻糖基转移酶基因OsIAGTl的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]上述水稻糖基转移酶基因OsIAGTl编码的糖基转移酶OsIAGTl在催化合成生长素糖酯中的应用，其中所述糖基转移酶OsIAGTl的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]上述糖基转移酶是通过糖基转移酶基因OsIAGTl在大肠杆菌中表达和纯化后获得的。糖基转移酶基因OsIAGTl是通过RT-PCR方法从水稻中克隆的。
[0011]上述生长素是指吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚丙酸(IPA)、萘乙酸(NAA)或2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
[0012]本发明提供新的糖基转移酶基因序列所编码的糖基转移酶OsIAGTl能够催化多种生长素物质形成糖酯。 [0013]将糖基转移酶OsIAGTl与生长素之一放于反应管中，按实施例2中所指出的条件进行酶促反应，即可催化合成相应的生长素糖酯。与以前已经报道的糖基转移酶不同的是，本发明所述糖基转移酶基因OsIAGTl是水稻中第一个被证明可用于生长素糖酯合成的糖基转移酶基因。
[0014](3)本发明实施后可能带来的有益效果
[0015]本发明是在国内外首次证明水稻的糖基转移酶基因OsIAGTl可用于催化多种生长素化合物生成其糖酯物质。尽管在水稻的基因组测序完成以后，基因组序列注释中指出许多基因序列可能编码糖基转移酶，但在公开文献中没有发现任何水稻的糖基转移酶能够在试管中催化合成生长素的糖酯。本发明的公开为体外利用酶催化方法合成这些生长素物质的糖酯物提供了可行的方法。用提取方法或化学合成方法获得生长素糖酯物不仅效率低，而且缺乏专一性。而用糖基转移酶OsIAGTl催化方法则可以高效、专一性的合成吲哚乙酸、吲哚丁酸、吲哚丙酸、萘乙酸等相对应的的糖酯(见附图1至附图7)。本发明实施后将为生长素糖酯合成工业带来巨大经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1.纯化的融合蛋白GST-OsIAGTI用SDS-PAGE检测。其中，M为蛋白质分子量标记；序号I泳道为纯化的GST-OsIAGTl融合蛋白；序号2泳道为GST标签蛋白，作为对照。
[0017]图2.纯化后的融合蛋白GST-OsIAGTl催化吲哚乙酸(IAA)形成糖酯，催化产物用高效液相色谱(HPLC)分析。其中I为实验组，纯化的GST-OsIAGTl融合蛋白与IAA和UDP-葡萄糖的反应体系，比只含有GST标签蛋白的负对照反应体系多出一个明显的产物峰(箭头a所指)，该产物被推测为吲哚乙酸糖酯。图中的b为底物吲哚乙酸。2为正对照组，纯化的GST-UGT74D1融合蛋白与IAA和UDP-葡萄糖的反应体系。3为负对照组，纯化的GST标签蛋白与IAA和UDP-葡萄糖的反应体系，无糖酯合成。
[0018]图3.吲哚乙酸的催化产物用质谱(LC-MS)鉴定。IAA葡萄糖酯的分子量为337。在正离子模式下，母离子峰的m/z为355.14 (M+NH:)。另一峰的m/z为360.10 (M+Na+)。
[0019]图4.纯化后的融合蛋白GST-OsIAGTl催化吲哚丁酸(IBA)形成糖酯，催化产物用HPLC分析。其中I为实验组，纯化的GST-OsIAGTl融合蛋白与IBA和UDP-葡萄糖的反应体系，比只含有GST标签蛋白的负对照反应体系多出一个明显的产物峰(箭头a所指)，该产物被推测为吲哚丁酸糖酯。图中的b为底物吲哚丁酸。2为正对照组，纯化的GST-UGT74D1融合蛋白与IBA和UDP-葡萄糖的反应体系。3为负对照组，纯化的GST标签蛋白与IBA和UDP-葡萄糖的反应体系，无糖酯合成。
[0020]图5.吲哚丁酸的催化产物用质谱(LC-MS)鉴定。IBA葡萄糖酯的分子量为365。在正离子模式下，母离子峰的m/z为383.16 (M+NH:)。另一峰的m/z为388.10 (M+Na+)。
[0021]图6.纯化后的融合蛋白GST-OsIAGTl催化吲哚丙酸(IPA)形成糖酯，催化产物用HPLC分析。其中I为实验组，纯化的GST-OsIAGTI融合蛋白与IPA和UDP-葡萄糖的反应体系，比只含有GST标签蛋白的负对照反应体系多出一个明显的产物峰(箭头a所指)，该产物被推测为吲哚丙酸糖酯。图中的b为底物吲哚丙酸。2为负对照组，纯化的GST标签蛋白与IPA和Μ)Ρ-葡萄糖的反应体 系，无糖酯合成。
[0022]图7.纯化后的融合蛋白GST-OsIAGTl催化萘乙酸(NAA)形成糖酯，催化产物用HPLC分析。其中I为实验组，纯化的GST-OsIAGTI融合蛋白与NAA和UDP-葡萄糖的反应体系，比只含有GST标签蛋白的负对照反应体系多出一个明显的产物峰(箭头a所指)，该产物被推测为萘乙酸糖酯。图中的b为底物萘乙酸。2为负对照组，纯化的GST标签蛋白与NAA和UDP-葡萄糖的反应体系，无糖酯合成。
【具体实施方式】
[0023]实施例1水稻糖基转移酶基因OsIAGTl的克隆、原核表达与酶蛋白纯化
[0024]1.水稻糖基转移酶基因OsIAGTl的克隆
[0025]本发明涉及的糖基转移酶基因OsIAGTl是通过RT-PCR扩增技术从水稻中克隆的。首先利用TRIzoI方法从水稻幼嫩叶片提取RNA，然后用RT-PCR方法扩增得到该基因的编码区cDNA。扩增时用的引物是:
[0026]OsIAGTl-ΡΙ:5’-GCCGGATCCATGGCGCATGTCCTTGTC-3’ ；
[0027]0sIAGTl-P2:5’-GCCCTCGAGTCACATCTCCGACGCTGC-3’ ；
[0028]OsIAGTl-exl:
[0029]5，-GGGTCGACAACCCAGCCAAAACCTCGCTCTCCAGCTCGTCGAACGAGT-3，；
[0030]0sIAGTl-ex2:5，-TGGAGAGCGAGGTTTTGGCTGGGTTGTCGACCC-3，，用 Pl 和 exl 扩增第一个外显子，用P2和ex2扩增第二个外显子，然后用P1、P2引物将两个外显子融合，得到全长 cDNA。RT-PCR 扩增程序为:94°C (预变性)，5min ;94°C (变性)，10s ;55°C (退火)，15s ;72°C (延伸)，2min ;35cycle ;72°C (终延伸)，lOmin。回收并纯化扩增产物。将扩增获得的目的基因OsIAGTl与EcoRV单酶切的中间载体pBluescript SK连接，获得载体pB OsIAGTl,对克隆到的基因进行测序。
[0031]2.0sIAGTl的序列信息与特性
[0032]对克隆的糖基转移酶基因OsIAGTl测序后发现，该基因的cDNA编码区长度为1515bp，编码504个氨基酸，编码的蛋白质分子量为52.9KD，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。其C端有一个含44个氨基酸的PSPG盒，该盒是催化小分子化合物的糖基转移酶共同具有的保守序列，说明克隆的基因是水稻的糖基转移酶基因。
[0033]3.水稻糖基转移酶基因OsIAGTl的原核表达载体构建
[0034]在公开通用的原核表达载体PGEX-2T的基础上，按照《分子克隆》(Sambrook等编著)所示的方法，对该载体进行改造，使其多克隆位点包含BamHl，Xhol。用BamHl，Xhol双酶切该表达载体，回收载体片段备用。同时用BamHl，Xhol双酶切前述载体pB_OsIAGTl，回收得到目的基因片段，并将其连入上述原核表达载体中，得到水稻糖基转移酶基因OsIAGTl的原核表达载体pGEX-OsIAGTl。
[0035]4.转化大肠杆菌、诱导蛋白表达及酶蛋白的纯化
[0036]将上述原核表达载体pGEX-OsIAGTl转化大肠杆菌菌株XLl_Blue，PCR和酶切验证正确后，保存菌种，此菌种用于融合蛋白(GST-OsIAGTl)的表达纯化。
[0037]在添加了氨苄青霉素(100mg/L)的2XYT液体培养基中过夜培养上述菌种，以活化该菌种。然后将过夜培养物按照1:100 (过夜培养物:新的2X YT液体培养基)的比例扩大至75ml培养液中，37°C培养至0D_=0.8。然后加入IPTG至0.2mM，转到20°C震荡培养24h以诱导目的蛋白表达。到时间后通过离心收集菌体。
[0038]菌体加入2ml Blast Buffer (0.5mM EDTA，750mM 蔗糖，200mM Tris_HCl，pH=8.0)重悬,立即加入14ml稀释的(1/2 X )Blast Buffer (事先添加2mg溶菌酶),混匀后于冰上放置30min，离心收集菌体，用PBS(内含0.2mM的PMSF)重悬，冰上放置30min后1000Orpm离心20min，取上清。在上清中加入100 μ I的谷胱甘肽琼脂糖珠子，按照pGEX蛋白纯化手册操作，最后用Elution Buffer (50mM Tris-HCl，IOmM还原型谷胱甘肽，pH=8.0)洗脱目的蛋白。目的蛋白的纯度用SDS-PAGE方法检测，蛋白浓度按照Bradford试剂盒说明书中的方法进行测定(用BSA作为蛋白标准)。
[0039] 实施例2水稻糖基转移酶OsIAGTl催化生长素糖酯的合成
[0040]1.生长素的酶催化反应
[0041]用纯化得到的水稻糖基转移酶OsIAGTl的融合蛋白(GST-OsIAGTl，能够反映OsIAGTl的催化活性，属于常用的做法)进行体外试管中的酶催化反应，选取5种生长素化合物作为底物，包括吲哚乙酸(IAA)、吲哚丙酸(IPA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。催化反应中用UDP-葡萄糖作为糖的供体。酶促反应体系如下:
[0042]
【权利要求】
1.一种水稻糖基转移酶基因OsIAGTI，其特征在于:所述水稻糖基转移酶基因OsIAGTI的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述水稻糖基转移酶基因OsIAGTI编码的糖基转移酶OsIAGTI在催化合成生长素糖酯中的应用，其中所述糖基转移酶OsIAGTI的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述生长素是吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚丙酸(IPA)、萘乙酸(NAA)或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
【文档编号】C12P19/02GK103642824SQ201310613945
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】侯丙凯, 林继山, 王会勇 申请人:山东大学