专利名称：一种复合菌剂及接种于堆肥增进快速腐熟的方法
技术领域：
本发明涉及农业废弃物堆肥化处理技术，特别涉及一种复合菌剂及接种于堆肥增
进快速腐熟的方法。
背景技术：
我国作为农业大国，已成为世界上农业废弃物产出量最大的国家，据不完全统计， 每年产生畜禽粪便约为26. 0亿吨，农作物秸秆约为7. 0亿吨，远远超过工业、生活废水的排 放总量。这些农业废弃物如不进行科学处理，不仅不能作为一种资源加以利用，相反这些固 形废弃物所含有的大量病原茵，导致废弃物腐烂所产生的强烈恶臭等问题将给环境带来严 重污染。堆肥是最常用的无害化、资源化处理畜禽粪便及秸秆的有效方法，但传统的自然堆 肥法不仅发酵时间长，而且发酵温度不高，难以杀灭堆料中所含有的大量虫卵病菌，堆料无 害化程度低，且肥力也较低。为此，科技人员进行了以微生物种群促使对堆肥有机物降解的 应用研究，并取得了不同程度的成效。然而，堆肥腐熟是一个生物学的过程，其发酵不同的 阶段须由不同的、相对应的微生物种群促进反应，才能达到快速腐熟的效果。而从目前的 关于堆肥接种的大量报道可见，其所接种的微生物大都属中温性的微生物菌剂，它们虽然 能縮短堆肥启动发酵的时间，使堆肥迅速进入高温期，但由于所接种的中温性微生物将在 高温期内迅速死亡，故而短暂高温期后便是降温期，堆肥腐熟时间依然较长，而且腐熟不彻 底，难以达到人们预期的堆肥腐熟效果。这是因为堆肥最重要的阶段是高温期，因为大多数 的有机物特别是纤维素、半纤维素等物质须在高温期分解，高温期的长短决定了整个堆肥 腐熟的时间，相对较长的高温期可以縮短堆肥堆制时间，使堆肥快速腐熟获得成功。
发明内容
本发明提出了一种复合菌剂及接种于堆肥增进快速腐熟的方法，目的在于通过选 择接种高温微生物的复合菌剂接种于堆肥，以实现堆肥发酵尽快进入启动期，延长堆肥高 温分解期，加快大分子有机物分解，提高腐熟成品质量，縮短整个堆肥的堆制时间。
本发明的技术解决方案 本发明选择五种高温微生物菌种，各菌种进行单独扩大培养后，按比例复配成复 合菌剂。 所述的五种高温微生物菌种均从腐熟的堆肥中筛选获得，分别是
(1) 土芽孢杆菌(Geobacillus)E3菌株。该菌株是在高温5(TC的状态下，以纤维 素作为唯一碳源条件下筛选出来的细菌菌株。该菌株由发明人筛选，保藏于南京农业大学 农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，菌株保藏编号为NAECC 0156， GenBank注册 号为DQ232877 ; (2)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DG-3菌株。该菌株是在高温50°C 的状态下，是以果胶为唯一碳源条件下筛选出来的细菌菌株。该菌株由发明人筛选，保藏于 于南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室；
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(3)木霉(Trichoderma)M8菌株。该菌株是水解纤维素能力较强的木霉菌株。该 菌株由发明人筛选，保藏于江苏食品职业技术学院微生物实验室； (4)木霉(Trichoderma)M26菌株。该菌株是水解纤维素和半纤维素能力较强的木
霉菌株。该菌株由发明人筛选，保藏于江苏食品职业技术学院微生物实验室； (5)放线菌(Str印tomyces)CCS3菌株。该菌株是在高温5(TC的状态下，以纤维素
为唯一碳源条件下筛选出来的放线菌菌株。该菌株由发明人筛选，保藏于江苏食品职业技
术学院微生物实验室。 所述的五种高温微生物菌种各进行单独扩大培养
(1)培养基的制备与菌种单独扩大培养
①细菌培养基的制备与菌株的扩大培养；
②放线菌培养基的制备与菌株的扩大培养；
③真菌培养基的制备与菌株的扩大培养。
(2)复合菌剂的制备 上述各单独扩大培养后的菌种E3、 DG-3、 M8、 M26、 CCS3复配成复合菌剂的重量份
比例依次为20 30 : io 20 : io 25 : 10 20 : 20 35。
本发明所述的复合菌剂接种于堆肥增进快速腐熟方法的步骤是 (1)将粉碎好的秸秆与动物新鲜粪便混合，使混合料含水量为65% 70%，并调
节pH值为7. 6-8. 0左右； (2)按堆料重量1%。 5%。的复合菌剂量接种于堆料，并翻拌均匀后，移入发酵池 进行好氧发酵； (3)发酵池通过空气压縮机均匀通入空气，在不同发酵阶段通气量、通气时间不 同； (4)定期测温与翻堆； (5)定期检测从堆肥不同位置取样，进行样品生物指标与理化指标分析，达标则
堆肥完全腐熟。 本发明的有益效果 本发明对堆肥人工接种性状优良的高温纤维分解细菌、放线菌和霉菌组成的复合 菌剂，与对照堆肥相比提前一周达到高温期，加速了堆肥腐熟的进程，并且高温期持续长达 14天，因而有利于堆肥有机质的分解和腐殖化，堆肥20天左右便腐熟，提高了堆肥腐熟速 度。所腐熟的堆料经检测，其中杂草种子、蛔虫卵及大肠杆菌绝大多数已死亡，且比对照堆 肥腐殖酸含量高出25g/kg，腐殖化系数大于1. 9，腐熟成品呈黑褐色、无臭味、稳定性好，品 质达到无害化、减量化标准，具有明显的环境效益和经济效益。
附图1为接种堆肥和对照堆肥堆制过程中温度实测对比图； 附图2为接种堆肥和对照堆肥堆制过程中C/N实测对比图； 附图3为接种堆肥和对照堆肥堆制过程中全碳与腐殖酸含量实测对比图； 附图4为接种堆肥和对照堆肥堆制过程中胡敏酸、腐殖化系数实测对比图； 附图5为接种堆肥和对照堆肥堆制过程中发芽指数(GI)实测对比图。
具体实施例方式
本发明所涉及的五种已获得筛选的高温微生物菌种，在进行单独扩大培养前，须
进行培养基的制备。( — )培养基的制备 (1)细菌培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)制备 取牛肉膏5. 0g、蛋白胨10. Og、 NaC15. Og、自来水1000mL混合搅拌，并对混合液以
12rC高温灭菌20min，获得细菌培养基。(2)放线菌培养基(高氏一号培养基)制备 先用少量冷水将可溶性淀粉20. Og调成糊状，边加热边搅拌，再取KN031. Og、 K2HP040. 5g、 MgS04 7H20 0. 5g、 NaClO. 5g、 FeS04 7H20 0. Olg和一定量的水加入糊状淀粉 中，调pH为7. 8 8. O，待上述成分全部溶解后再补足水分至1000mL，此混合液以12rC高 温灭菌20min，获得放线菌培养基。另在临用前在该培养基中加入重铬酸钾溶液，加入量为 每300mL培养基中加入3%重铬酸钾lmL。
(3)真菌培养基制备 ①活化及一级种子培养基(查氏培养基)的制备取蔗糖30. 0g、 NaCl 2g、 KC1 0. 5g、 KH2P041. 0g、 MgS04 7H20 0. 5g、 FeS04 7H20 0. Olg、自来水lOOOmL配制成溶液，该培养基灭菌后，加入青霉素(用量为2000单位/ml) 和链霉素(用量为100单位/ml)。
②固体麸皮培养基的制备 取麸皮与水重量份之比为1 : (1 1. 2)，调和搅拌，物料含水量约为65%左右， 灭菌后备用。 ( 二 )各菌种进行单独扩大培养
(1)E3菌株的扩大培养 将纯化培养的一级斜面E3菌株接种至细菌培养基中，操作步骤是每1000mL的三 角瓶中装入细菌培养液200mL，于5(TC的温度条件下，以旋转摇床设定转速160 240rpm、 培养18 24h ;培养后的液体菌种采用菌落计数法计数，使每克培养液的菌数在109个以 上；将培养好的液体菌种以4% 6% (v/v)的接种量接种至容量为5L的发酵罐中通气培 养，培养温度45°C 50。C、搅拌转速30 60rpm、通气量0. 6 1. 2mVh、培养时间22 28h，培养后采用菌落计数法计数，使每克培养液的E3菌株菌数在109个以上；
(2)DG-3菌株的扩大培养 其扩大培养的过程与上述E3菌株的扩大培养过程相同；
(3)M8菌株的扩大培养 将纯化培养的一级斜面M8菌株接种至查氏培养基中，操作步骤是每1000mL的三 角瓶中装入查氏培养液200mL，于5(TC温度条件下，以旋转摇床设定转速220 240rpm，培 养30 48h ;培养后的M8菌株采用固体麸皮培养基进行固态扩大培养，即将灭菌后的固 体麸皮培养基置于曲盘内，冷却后接入初步扩培的霉菌悬液，待出现白色菌丝进行翻盘、补 水，继续培养至产生大量孢子，要求孢子数在每克109个左右，则完成扩大培养。
(4)M26菌株的扩大培养
其扩大培养的过程与上述M8菌株的扩大培养过程相同；
(5)CCS3菌株的的扩大培养 将纯化培养的一级斜面CCS3菌株接种至放线菌培养基(高氏一号培养基)中，操 作步骤是每1000mL的三角瓶中装入放线菌培养液200mL，于5(TC温度条件下，以旋转摇床 设定转速160 240rpm，培养18 24h ;将培养好的液体菌种以1% 3% (v/v)的接种量 接种至容量为5L的发酵罐中通气培养，培养温度45°C 5(TC、搅拌转速30 60rpm、通气 量0. 8 1. OmVh、培养24 32h，培养后采用菌落计数法计数，使培养后每克培养液的放 线菌菌数在109个以上。
(三)按比例复配成复合菌剂将上述各单独扩大培养后的菌种E3、 DG-3、 M8、 M26、 CCS3按重量份配比
20 : io : 25 : 18 : 27制成一号复合菌剂；按重量份配比23 : 12 : io : 20 : 35制 成二号复合菌剂；按重量份配比30 : 20 : 20 : io : 20制成三号复合菌剂；按重量份配 比25 : 15 : 15 : 15 : 30制成四号复合菌剂，各号复合菌剂留作备用可分别接种于堆 肥。(四)堆料上料、接种复合菌剂、堆肥发酵腐熟 (1)将粉碎好的长度为30 50mm的秸秆与动物新鲜粪便(如取含水量70% 90%的牛粪)混合，使混合料总含水量为65X，并加入石灰粉调节pH值为7.6左右；
(2)按3%。 5%。的复合菌剂量接种于堆料，并翻拌均匀，移入发酵池进行好氧发 酵；所述发酵池为人工混凝土结构，其长、宽、高为1000mmX1500mmX800mm，池底中部设有 铁制格栅，以及时排放残留废水。距发酵池底部90mm处安装通气管，以有利于通气好氧发 酵和堆内水分的挥发。 (3)发酵池通过空气压縮机均匀通入空气，通气量以气体流量计控制，堆料开始升 温阶段及高温发酵阶段通气量为2 4mVh，以促进堆肥温度迅速上升、加快高温堆肥发酵 速度，降温发酵阶段通气量为0. 5 1. 5mVh。 (4)定期测温、翻堆对发酵池内堆料进行温度测量，测量时温度计插入距堆体表 面25 30cm以下，同时记录周围环境温度，视发酵温度变化情况，每隔三、四天进行一次翻 堆。 (5)定期检测定期从堆肥不同位置取样进行生物指标、理化指标分析，当所有指 标满足要求，表明堆肥完全腐熟。 本发明为作堆肥温度、C/N比的变化、腐殖化系数变化和种子发芽指数等理化和生 物学指标的优劣对比，设置了对照堆肥。对照堆肥的原料的来源、预处理方式与接种堆肥完 全相同，仅是对照堆肥不予接种本复合菌剂，并在同样的环境温度下，以同样的检测手段进 行比较。
本发明以所制备的四号复合菌剂应用于接种堆肥处理
如图1所示， 堆肥接种后，前期表现发酵升温速度快，接种两天内温度即能达到50°C 65°C， 第三天即达到73°C，比对照堆肥提前7天达到高温期，并且高温阶段持续期比对照堆肥持 续期长，有利于堆肥的分解和腐殖化，加速了堆肥腐熟的进程。由于发酵升温快，温度高，经 检测，五天左右接种堆的杂草种子便死亡，堆肥中蛔虫卵及大肠杆菌数已达到堆肥无害化标准的要求。 如图2所示， 该图表明了 C/N比的变化，接种堆肥腐熟时间比对照堆肥縮短了 14d。从全碳变化
曲线可见，接种堆肥可以提高堆肥中有机物的降解率。 如图3、4所示， 接种堆肥完成腐熟时，腐殖酸含量比对照堆肥含量高出25g/kg，表明接种复合菌 群有利于腐殖酸的形成，其中所检测的胡敏酸含量变化，反映接种堆肥稳定化程度明显高 于对照堆肥，接种堆肥堆制13d时，腐殖化系数已大于1. 9，比对照堆肥提前7天达到腐熟标 准。 如图5所示， 接种堆肥的油菜种子的发芽指数第12d已达到79. 7%，表明同期接种堆肥已初步 腐熟，而对照堆肥第24d还低于此值。 综上可见，本发明方案所用的复合菌剂接种堆肥后，比对照堆肥提前7 14天达 到腐熟标准，且腐熟成品颜色呈黑褐色、无臭味、颗粒松散，接种堆肥成品质量高、稳定性 好，完全可达到无害化、减量化要求；本发明处理植物秸秆及畜禽粪便等废弃物，具有明显 效果，能够变废为宝，可切实解决农民处理有机废物困难的实际问题，具有很好的应用前 景。因而，本发明达到了预期的发明目的。
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权利要求
一种复合菌剂，其特征在于它是由五种高温微生物菌种，各菌种进行单独扩大培养后，按比例复配成的复合菌剂，所述的五种高温微生物菌种为(1)土芽孢杆菌(Geobacillus)E3菌株、(2)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DG-3菌株、(3)木霉(Trichoderma)M8菌株、(4)木霉(Trichoderma)M26菌株、(5)放线菌株(Streptomyces)CCS3菌株；所述的五种高温微生物菌种各进行单独扩大培养，并依E3、DG-3、M8、M26、CCS3的次序，按重量份20～30∶10～20∶10～25∶10～20∶20～35复配成复合菌剂。
2. 根据权利要求1所述一种复合菌剂，其特征在于所述的五种高温微生物菌种进行单独扩大培养是① 细菌培养基的制备与菌株的扩大培养、② 放线菌培养基的制备与菌株的扩大培养、③ 真菌培养基的制备与菌株的扩大培养。
3. 根据权利要求2所述一种复合菌剂，其特征在于所述的真菌培养基制备与菌株的扩大培养是① 活化及一级种子培养基(查氏培养基)的制备取蔗糖30. 0g、NaCl 2g、KCl 0. 5g、KH2P04 1. 0g、MgS04 7H20 0. 5g、FeS04 7H20 0. 01g、自来水lOOOmL配制成溶液，该培养基灭菌后，加入青霉素2000单位/ml和链霉素100单位/ml。② 固体麸皮培养基的制备取麸皮与水重量份之比为l : (1_1.2)调和搅拌，物料含水量约为65%左右，灭菌后备用。
4. 根据权利要求1所述一种复合菌剂，其特征在于所述的各菌种进行单独扩大培养是(1) E3菌株的扩大培养将纯化培养的一级斜面E3菌株接种至细菌培养基中，操作步骤是每lOOOmL的三角瓶中装入细菌培养液200mL，于5(TC的温度条件下，以旋转摇床设定转速160 240rpm、培养18 24h ;培养后的液体菌种采用菌落计数法计数，使每克培养液的菌数在109个以上；将培养好的液体菌种以4% 6% (v/v)的接种量接种至容量为5L的发酵罐中通气培养，培养温度45°C 50。C、搅拌转速30 60rpm、通气量0. 6 1. 2mVh、培养时间22 28h，培养后采用菌落计数法计数，使每克培养液的E3菌株菌数在109个以上；(2) DG-3菌株的扩大培养其扩大培养的过程与上述E3菌株的扩大培养过程相同；(3) M8菌株的扩大培养将纯化培养的一级斜面M8菌株接种至查氏培养基中，操作步骤是每1000mL的三角瓶中装入查氏培养液200mL，于5(TC温度条件下，以旋转摇床设定转速220 240rpm，培养30 48h ;培养后的M8菌株采用固体麸皮培养基进行固态扩大培养，即将灭菌后的固体麸皮培养基置于曲盘内，冷却后接入初步扩培的霉菌悬液，待出现白色菌丝进行翻盘、补水，继续培养至产生大量孢子，要求孢子数在每克109个左右，则完成扩大培养。(4) M26菌株的扩大培养其扩大培养的过程与上述M8菌株的扩大培养过程相同；(5) CCS3菌株的的扩大培养将纯化培养的一级斜面CCS3菌株接种至放线菌培养基(高氏一号培养基)中，操作步骤是每lOOOmL的三角瓶中装入放线菌培养液200mL，于5(TC温度条件下，以旋转摇床设定转速160 240rpm，培养18 24h ;将培养好的液体菌种以1 % 3% (v/v)的接种量接种至容量为5L的发酵罐中通气培养，培养温度45°C 5(TC、搅拌转速30 60rpm、通气量0. 8 1. OmVh、培养24 32h，培养后采用菌落计数法计数，使培养后每克培养液的放线菌菌数在109个以上。
5. —种复合菌剂接种于堆肥增进快速腐熟的方法，其特征在于该方法的步骤是(1) 将粉碎好的秸秆与动物新鲜粪便混合，使混合料含水量为65% 70X，并调节pH值为7. 6-8. 0左右；(2) 按堆料重量1%。 5%。的复合菌剂量接种于堆料，并翻拌均匀后，移入发酵池进行好氧发酵；(3) 发酵池通过空气压縮机均匀通入空气，在不同发酵阶段通气量、通气时间不同；(4) 定期测温与翻堆；(5) 定期检测从堆肥不同位置取样，进行样品生物指标与理化指标分析，达标则堆肥完全腐熟。
6. 根据权利要求5所述的一种复合菌剂接种于堆肥增进快速腐熟的方法，其特征在于该方法的具体步骤是(1) 将粉碎好的长度为30 50mm的秸秆与动物新鲜粪便(如取含水量70% 90%的牛粪)混合，使混合料总含水量为65 % ，并加入石灰粉调节pH值为7. 6左右；(2) 按3%。 5%。的复合菌剂量接种于堆料，并翻拌均匀，移入发酵池进行好氧发酵；所述发酵池为人工混凝土结构，其长、宽、高为1000mmX1500mmX800mm，池底中部设有铁制格栅，以及时排放残留废水。距发酵池底部90mm处安装通气管，以有利于通气好氧发酵和堆内水分的挥发。(3) 发酵池通过空气压縮机均匀通入空气，通气量以气体流量计控制，堆料开始升温阶段及高温发酵阶段通气量为2 4mVh，以促进堆肥温度迅速上升、加快高温堆肥发酵速度，降温发酵阶段通气量为0. 5 1. 5mVh。(4) 定期测温、翻堆对发酵池内堆料进行温度测量，测量时温度计插入距堆体表面25 30cm以下，同时记录周围环境温度，视发酵温度变化情况，每隔三、四天进行一次翻堆。(5) 定期检测定期从堆肥不同位置取样进行生物指标、理化指标分析。
全文摘要
本发明提出了一种复合菌剂及接种于堆肥增进快速腐熟的方法。该方法通过从腐熟堆肥中筛选出的土芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、两种木霉菌、放线菌等高温微生物菌种，进行单独扩大培养后，按比例复配成复合菌剂。该复合菌剂按一定比例接种于堆肥，移入发酵池，进行通气好氧发酵，完成堆肥腐熟。本发明方案的接种堆肥与对照堆肥相比，提前一周达到高温期，且高温持续期长达14天，有利于堆肥的有机质的分解和腐殖化，堆肥接种后，20天左右便腐熟。腐熟的堆肥经检测，堆料中杂草种子、蛔虫卵及大肠杆菌绝大多数已死亡，且比对照堆肥腐殖酸含量高出25g/kg，腐殖化系数大于1.9，腐熟成品呈黑褐色、无臭味、稳定性好，品质达到无害化、减量化标准，具有明显的环境效益和经济效益。
文档编号C12R1/885GK101696393SQ20091003564
公开日2010年4月21日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者刘连成, 陆正清 申请人:江苏食品职业技术学院;