一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，包括以下步骤：(1)采集作物根围土壤，去杂，接种于灭菌水中，25-35℃条件下培养2-3小时，分离上清液；(2)制备CAS-P检测平板，将CaCl2溶液、MgSO4·7H2O溶液、质量浓度为8-12％的酸水解酪蛋白溶液混合均匀，向其中加入Ca3(PO4)2，调节pH为6.8-7.0，用水定容；加入琼脂粉，灭菌，灭菌后待温度降至50-60℃时，再加入CAS蓝色检测液，混匀后倒平板，即得；(3)将步骤(1)的上清液接种于CAS-P检测平板上，接种量为100-200uL/平板，25-35℃条件下培养3-5天，在该检测平板上生长的菌株即为嗜铁解磷细菌。采用本发明的筛选方法，简化了分离筛选步骤，大大缩短筛选时间，提高了嗜铁解磷细菌的分离筛选效率。
【专利说明】一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法。
【背景技术】
[0002]铁是大多数生物必需的微量元素之一，虽然在地壳中铁元素的含量占第四位，但大部分不能被植物直接利用，需要一套高效的铁转运机制获取它们所需的铁离子。在低铁环境下，大多数细菌能够合成并分泌嗜铁素，供其自身和植物利用，促进植物生长；并通过与病原微生物争夺有限的铁营养，抑制病原微生物的生长繁殖，起到生物防治的作用。
[0003]磷是植物生长不可缺少的营养元素之一，尽管每年都向土壤中施入大量可溶性磷肥，然而，磷酸盐在土壤中常以磷酸三钙为主，这类磷酸盐溶解性差，难于被植物吸收利用，作物对磷肥的当季利用率一般只有5%~10%，加上作物的后效，利用率不超过25%。分离筛选出具有高效解磷作用的微生物菌株并制成微肥，是解决磷肥利用率低，控制滥用肥料带来的环境污染问题的有效方法。
[0004]对于具有嗜铁或/和解磷能力的植物根际促生菌(Plant Growth-PromotingRhizobacteria,简称PGPR)的筛选，并用于农业生产中解决植物缺铁黄化以及磷肥利用率低等问题，已有一些相关报道。然而现有的技术中，嗜铁细菌和解磷细菌是分开筛选的，即使有些菌株具有嗜铁和解磷等多种防病促生机制，其嗜铁能力或解磷能力是分别检测的，步骤复杂，筛选效率低，费时费力。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，在一种培养基上即可短时间内筛选获得同时具有嗜铁和解磷能力的细菌菌株，简化了分离筛选步骤，大大缩短筛选时间，提高了嗜铁解磷细菌的分离筛选效率。
[0006]为实现上述目的，本发明采用下述技术方案:
[0007]一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，包括以下步骤:
[0008](I)采集作物根围土壤，去杂，接种于灭菌水中，接种量为0.5-1.5g/100mL水，25-35°C条件下培养2-3小时，静置，分离上清液，备用；
[0009](2)制备CAS-P检测平板，将CaCl2溶液、MgSO4.7H20溶液、质量浓度为8_12%的酸水解酪蛋白溶液混合均匀，向其中加入Ca3(PO4)2,调节pH为6.8-7.0，用水定容，每10mL定容溶液中含有CaCl2溶液0.1-0.3mL, MgSO4.7H20溶液0.1-0.3mL,酸水解酪蛋白溶液4-8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g ;加入琼脂粉，琼脂粉的加入量为l_3g/100mL定容溶液，灭菌，灭菌后待温度降至50-60°C时，再加入CAS蓝色检测液，CAS蓝色检测液的加入量为3-8mL/100mL定容溶液,混匀后倒平板，即得；
[0010] (3)将步骤(1)的上清液接种于CAS-P检测平板上，接种量为100-200uL/平板，25-35°C条件下培养3-5天，在该检测平板上生长的菌株即为嗜铁解磷细菌。
[0011]步骤(1)中，培养时，以150-200r/min进行振荡培养；
[0012]步骤(2)中，所述CaCl2溶液和MgSO4.7H20溶液的浓度均为lmmol/L ；
[0013]步骤⑵中，所述CAS蓝色检测液的制备方法为:将0.07g的铬天青(Chromeazurol S, CAS)溶于50mL去离子水中，再加入10mT, lmmol/L的FeCl3溶液(含有1mmol/L的HCL),为溶液A ;将0.06g的溴化十六烷基三甲铵(Hexadecyltrimethylammoniumbromide, HDTMA)溶于40mL去离子水中，为溶液B ;将溶液A缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与溶液B混合均匀，即得到CAS蓝色检测液。
[0014]步骤(2)中，调节pH所用的试剂为生物缓冲液1，4-哌嗪二乙磺酸。
[0015]步骤(2)中，所述定容用的水为去离子水、纯化水或蒸馏水。
[0016]步骤(2)中，所述灭菌的温度为121°C，灭菌时间为15分钟。
[0017]优选的，步骤(1)中，接种量为1.0g/100mL。
[0018]优选的，步骤⑵中,所述CAS-P检测平板的制备方法为:将lmmol/L的CaCl2溶液
0.2mL、lmmol/L的MgSO4.7H20溶液0.2mL、质量浓度为10%的酸水解酪蛋白溶液6mL混合均匀，向其中加入Ca3(PO4)20.5g，调节pH为6.8-7.0，用去离子水定容至10mL,加入2g琼脂粉，灭菌，灭菌后待温度降至50-60°C时，再加入3-8mL CAS蓝色检测液，混匀后倒平板，即得。
[0019]本发明的有益效果:
[0020]本发明的嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，在一种培养基上即可短时间内筛选获得同时具有嗜铁和解磷能力的细菌菌株，简化了分离筛选步骤，大大缩短筛选时间，提高了嗜铁解磷细菌的分离筛选效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明所采用的CAS-P检测平板的筛选结果；
[0022]图2为细菌嗜铁能力的检测结果，图中a为菌株在CAS检测平板上产生的嗜铁圈子；b为阴性对照，即无嗜铁能力的菌株在CAS检测平板上的生长情况；c为空白CAS检测平板；
[0023]图3为固体平板细菌解磷能力的检测结果；
[0024]图4为液体培养条件下细菌解磷能力的检测结果。
【具体实施方式】
[0025]下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0026]实施例中所用到的的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]实施例1
[0028]一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，包括以下步骤:
[0029](I)采集作物根围土壤，去杂，接种于灭菌水中，接种量为1.0g/100mL，30°C条件下培养2.5小时，静置，分离上清液，备用；
[0030](2)制备 CAS-P 检测平板，先配制好 lmmol/L 的 CaCl2 溶液、lmmol/L 的 MgSO4.7Η20溶液、质量浓度为10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分钟单独灭菌)；再分别取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10 %的酸水解酪蛋白溶液，向其中加入Ca3 (PO4) 20.5g,用生物缓冲液 1，4-哌嗪二乙横酸[piperazine-N, N-bis (2-ethanesulfonic acid)，Pipes]，调ρΗ6.8~7.0。去离子水定容到100mL。加入2g琼脂粉，121°C，15分钟灭菌。灭完菌后，当温度降低到60°C时，以5mL CAS蓝色检测液/每10mL培养基的量沿着三角瓶壁加入，混合均匀后倒平板，即得，注意不要产生气泡，影响平板检测实验；
[0031](3)将步骤⑴的上清液接种于CAS-P检测平板上，接种量为150uL/平板，30°C条件下培养5天，观察平板上菌落的生长情况，结果见图1。结果显示:在CAS-P检测平板上长出少数几个细菌菌落，没有明显的晕圈
[0032]步骤(2)中,CAS蓝色检测液的制备方法为:将0.07g的铬天青(Chrome azurol S，CAS)溶于50mL去离子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，为溶液 A ;将 0.06g 的溴化十六烷基三甲铵(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去离子水中，为溶液B ;将溶液A缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与溶液B混合均匀，即得到CAS蓝色检测液。
[0033]实施例1筛选出的菌株的性能试验:
[0034]无机磷细菌液体培养基:葡萄糖10g, (NH4)2SO40.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g,MgSO4.7Η200.3g, Ca3 (PO4) 25.0g, FeSO4.7Η20 0.03g, MnSO4.4Η20 0.03g，定容至 100mL,ρΗ7.0~7.5。分装后121°C，15分钟灭菌。
[0035]无机磷细菌固体培养基:葡萄糖10g, (NH4)2SO40.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g,MgSO4.7Η200.3g, Ca3 (PO4)21g, FeSO4.7Η20 0.03g, MnSO4.4Η20 0.03g，琼脂粉 18 ~20g,定容至100mL, ρΗ7.0~7.5。分装后121。。，15分钟灭菌。
[0036] CAS检测平板:I) CAS蓝色检测液的制作:将0.07g的铬天青(Chrome azurol S,CAS)溶于50mL去离子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，为溶液 A ;将 0.06g 的溴化十六烷基三甲铵(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去离子水中，为溶液B ;将溶液A沿着烧杯的壁缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与溶液B混合均匀，即得到溶液C =CAS蓝色检测液。121°C，15分钟灭菌。2)CAS检测平板的制作:先配制好lmmol/L的CaCl2溶液、lmmol/L的MgSO4.7H20溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分钟单独灭菌);再分别取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10%的酸水解酪蛋白溶液，用生物缓冲液1，4-哌嗪二乙磺酸[piperazine-N, N~bis (2-ethanesulfonic acid), Pipes],调 ρΗ6.8 ~7.0。去离子水定容到100mL。加入2g琼脂粉，121°C，15分钟灭菌。当以上的固体培养基灭完菌后，温度降低到60°C时，以5mL CAS蓝色检测液/每10mL培养基的量沿着三角瓶壁加入，混合均匀后倒平板。注意不要产生气泡，以免影响平板检测实验。
[0037]缺铁培养基(g/L)=K2HPO40.1 ；KH2P043.0 ；MgS04.7Η20，0.2 ； (NH4)2SO4, 1.0 ;琥珀酸4.0，分装后121°C，15分钟灭菌。
[0038]1.固体平板上细菌嗜铁能力的检测
[0039]将CAS-P平板上长出的菌落接种于CAS检测平板上，将无嗜铁能力的菌株接种于CAS检测平板上作为阴性对照，未接种菌种的CAS平板作为空白对照，30°C条件下培养3天，观察菌落生长状况及橘黄色晕圈的产生，并测定菌落和橘黄色晕圈的直径。
[0040]结果显示，橘黄色晕圈/菌落直径比值为3.58 (图2)，说明该菌株具有较强的嗜铁能力。
[0041]2.固体平板上细菌解磷能力的检测
[0042]将CAS-P平板上长出的菌落同时接种于无机磷固体培养基平板上，30°C条件下培养3天，观察菌落生长状况及解磷圈的产生，并测定菌落和解磷圈的直径。
[0043]结果显示，解磷圈/菌落直径比值为2.92(图3)，说明该菌株具有较强的解磷能力。
[0044]3.液体培养条件下细菌嗜铁能力的检测
[0045]将CAS-P平板上长出的菌落接种于缺铁培养基中，30°C、150r/min条件下振荡培养48小时，室温静置2小时，取上清液5mL，加入等量CAS蓝色检测液，混匀，于630nm处测定吸光值。以不接种菌株的缺铁培养基为对照，重复3次。溶液中嗜铁素产量通过以下公式计算:
[0046]嗜铁素产量(％) = (Ar - As) /ArX 100%
[0047]其中，Ar为缺铁培养基和等量CAS蓝色检测液的吸光值，As为上清液和等量CAS蓝色检测液混合液的吸光值。
[0048]结果显示,本发明实施例1筛选出的菌株嗜铁素产量为89.65%。
[0049]4.液体培养条件下细菌解磷能力的检测
[0050]将CAS-P平板上长出的菌落接种于装有10mL以Ca3(PO4)2为唯一磷源的无机磷细菌液体培养基(PH7.0)的250mL三角瓶中，30°C，160r/min条件下振荡培养，接种后每天取5.0mL培养液，4000r/min离心10分钟，并经0.45 μ m微孔滤膜过滤，采用钥蓝比色法测定培养液中可溶性磷含量，并测定PH值。以不接种菌株的PVK液体培养基为空白对照，重复3次。
[0051]结果显示，接种上述菌株的培养液中，可溶性磷含量为58-456 μ g/mL,第5天最高(456 μ g/mL)，之后，可溶性磷含量下降；培养液中pH值的变化趋势与可溶性磷含量成反t匕，随着可溶性磷含量的增加，培养液的PH值降低，第5天，pH值降到最低，之后，随着可溶性磷含量的减少，培养液的PH值回升(图4)。
[0052]由此可见，采用本发明筛选方法获得的菌株同时具有嗜铁和解磷能力。
【权利要求】
1.一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采集作物根围土壤，去杂，接种于灭菌水中，接种量为0.5-1.5g/100mL水，25-35°C条件下培养2-3小时，静置，分离上清液，备用； (2)制备CAS-P检测平板，将CaCl2溶液、MgSO4.7H20溶液、质量浓度为8-12%的酸水解酪蛋白溶液混合均匀，向其中加入Ca3 (PO4) 2，调节pH为6.8-7.0，用水定容，每10mL定容溶液中含有CaCl2溶液0.1-0.3mL, MgSO4.7H20溶液0.1-0.3mL,酸水解酪蛋白溶液4_8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g ;加入琼脂粉，琼脂粉的加入量为l_3g/100mL定容溶液，灭菌，灭菌后待温度降至50-60°C时，再加入CAS蓝色检测液，CAS蓝色检测液的加入量为3-8mL/100mL定容溶液，混匀后倒平板，即得； (3)将步骤(1)的上清液接种于CAS-P检测平板上，接种量为100-200UL/平板，.25-35°C条件下培养3-5天，在该检测平板上生长的菌株即为嗜铁解磷细菌。
2.如权利要求1所述的一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，培养时，以150-200r/min进行振荡培养。
3.如权利要求1所述的一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，接种量为1.0g/100mL水。
4.如权利要求1所述的一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CaCl2溶液和MgSO4.7H20溶液的浓度均为lmmol/L。
5.如权利要求1所述的一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CAS蓝色检测 液的制备方法为:将0.07g的铬天青溶于50mL去离子水中，再加入1mLImmoI/L的FeCl3溶液，为溶液A ;将0.06g的溴化十六烷基三甲铵溶于40mL去离子水中，为溶液B ;将溶液A加入到B溶液中，混合均匀，即得到CAS蓝色检测液。
6.如权利要求1所述的一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，调节PH所用的试剂为生物缓冲液1，4-哌嗪二乙磺酸。
7.如权利要求1所述的一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述定容用的水为去离子水、纯化水或蒸馏水。
8.如权利要求1所述的一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述灭菌的温度为121°C，灭菌时间为15分钟。
9.如权利要求1所述的一种嗜铁解磷细菌的分离筛选方法，步骤(2)中，所述CAS-P检测平板的制备方法为:将lmmol/L的CaCl2溶液0.2mL、lmmol/L的MgSO4.7Η20溶液0.2mL、质量浓度为10%的酸水解酪蛋白溶液6mL混合均匀，向其中加入Ca3(PO4)20.5g，调节pH为.6.8-7.0，用去离子水定容至10mL,加入2g琼脂粉，灭菌，灭菌后待温度降至50_60°C时，再加入3-8mL CAS蓝色检测液，混匀后倒平板，即得。
【文档编号】C12N1/20GK104178440SQ201410432410
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】余贤美, 艾呈祥, 付丽, 安淼, 王海荣, 刘嘉芬 申请人:山东省果树研究所