一种产β-1,4葡聚糖酶的Providencia vermicola菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种普罗维登斯菌属(Providencia vermicola)6G菌株，于2013年8月8日将其保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心〔CCTCC〕，编号为：CCTCC NO:M2013364。本发明还公开了该菌株在发酵生产羧甲基纤维素酶以及制备降解纤维素的生物酶制剂上的应用前景。该菌株在最佳产酶条件下酶活可达0.15U/ml菌液。该酶在较广泛pH范围内呈现β-1,4葡聚糖酶酶活，且主要呈现碱性纤维素酶活力。酸性CMC酶的最适作用pH为6.0，碱性CMC酶的最适作用pH为8.5。酸性CMC酶活力约为碱性CMC酶活力的75％。
CCTCC NO: M2013364
2013.08.08
【专利说明】-种产β _1,4葡聚糖酶的Prov i dene i a verm i co I a菌株
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及从牛粪堆肥样品中筛选、分离、纯化、得 到的能产 β _1，4 葡聚糖酶的 Providencia vermicola6G。 技术背景
[0002] 木质纤维素是自然界储量丰富的可再生的有机化合物资源，主要由纤维素、半纤 维素和木质素三大类组分构成，同时还可能含有少量的果胶、几丁质、硅酸盐等成分。纤 维素是木质纤维中含量最高的组分，通常占总重量的35-45%，为一类由葡萄糖分子通过 β_1，4糖苷键连接形成的线状多聚葡萄糖。这一结构与通过α-1，4糖苷键连接形成葡聚 糖分子的淀粉类物质不同，因此不受淀粉水解酶类的水解。
[0003] 当前，全球社会面临着化石燃料日趋枯竭、环境污染严重的危机，使新的清洁能源 的开发利用成为一种迫切需求。木质纤维素可以通过一系列理化和生物的处理流程，转化 为清洁的乙醇、丁醇等清洁生物燃料，且可以再生的优质资源。有望有效地缓解化石燃料枯 竭带来的能源短缺。
[0004] 不过，由于纤维素的构成单元为葡萄糖，挖掘在温和条件下将其水解的生物酶制 齐IJ，无论是对该资源的开发，还是对纤维素加工产业（纺织、造纸等）的技术改进，都具有重 要的意义。经多年的研究发现，按作用的最适pH条件划分，纤维素水解酶通常可分为酸性 纤维素酶和碱性纤维素酶。
[0005] 酸性纤维素酶指作用的最佳pH条件在酸性范围的一类纤维素水解酶，目前发 现的主要由一些丝状真菌，如木霉、根霉等微生物产生，通常含有三种酶活力组分：1、 内切葡聚糖酶（endoglucanase)，即内切-β -1，4 葡聚糖酶（endo- β -1，4-glucanase， EC3. 2. 1.4)，简称内切酶（EG或BGL) ;2、外切葡聚糖酶，包括两类酶，一是β-Μ-D-葡萄 糖-葡萄糖水解酶（EC3. 2. 1. 74)，也称纤维糊精酶。二是β -1，4-D-葡聚糖-纤维二糖水解 酶，又称外切-1，4-葡聚糖酶（exo-β -1，4一glucanase，EC3. 2. 1. 91)或纤维二糖水解 酶（cellobiohydrolase，CBH)，简称外切酶；3、β _1，4_ 葡萄糖昔酶（β _1，4-glucosidase, EC3. 2. 1. 21)或β -葡萄糖苷-葡萄糖水解酶，简称β -葡萄糖苷酶（β -glucosidase， β-G)或纤维二糖酶（Cell〇biaSe，CB)等。这类纤维素酶通常能够将纤维素完全水解成游 离的葡萄糖分子，因此也称为纤维素水解完全酶，现主要用于纤维素资源开发研究、饲料工 业，以及纺织工业对棉料的表面处理。
[0006] 碱性纤维素酶则指在碱性条件下能够催化裂解纤维素分子的一类水解酶，最早在 上世纪70年代由日本科学家在嗜碱性的芽孢杆菌中发现。目前的研究表明，该类纤维素酶 一般只有纤维素内切酶，BP内切-β -1，4葡聚糖酶（endo-β -1，4-glucanase，EC3. 2. 1. 4， 简称内切酶，EG或BGL)的活性，活力用羧甲基纤维素（CMC)为底物测定，因此，也称为羧 甲基纤维素酶（CMCase)。其活性通常以CMC活性单位表示。由于碱性纤维素酶的作用pH 在碱性范围内，与纺织物洗涤条件比较一致，能够在温和条件下作用于污渍附着的位点，却 不会对衣物造成损害，所以，该酶类产品目前主要用于洗涤工业，为加酶洗涤产品的必需原 料。至今为止，能够产生碱性纤维素酶的微生物多为细菌菌株，包括芽孢梭菌属、纤维单胞 菌属、纤维弧菌属、混合纤维弧菌、芽孢杆菌属等的一些菌种，以及牛黄瘤胃梭菌、白色瘤胃 球菌、溶纤维菌，热纤梭菌、解纤维梭菌、粪碱纤维单胞菌等菌种，国外该类酶的工业化生产 主要以芽孢杆菌属的菌株（如Bacillus sp.KSM-635)为发酵菌种。国内的研究受制于缺 乏碱性纤维素酶的高产菌株鲜有大规模的发酵生产，挖掘新的微生物产纤维素酶菌株仍极 为必要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是从自然环境中分离筛选出一株新的产纤维素酶菌株，为木质纤维 素资源的开发利用提供一种有用的纤维素酶生产来源。
[0008] 本发明是这样实现的：
[0009] 申请人:从广西壮族自治区南宁市武鸣县郊的牛粪堆肥lcm深处采得样品，并从 中分离得到一株具有纤维素酶生产能力的细菌6G。经形态观察、BI0L0G生化鉴定以及基 于16s rDNA序列的分子鉴定，该菌株在分类学上属于Providencia vermicola 6G，申请 人于2013年8月8日将其保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心〔 CCTCC〕，编号为：CCTCC NO:M2013364。
[0010] 本发明除了要求保护上述的普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G菌株 夕卜，还要求保护其在发酵生产羧甲基纤维素酶以及制备降解纤维素的生物酶制剂上的应 用。
[0011] 所述的发酵生产羧甲基纤维素酶包括酸性羧甲基纤维素酶和碱性羧甲基纤维素 酶。
[0012] 所述的发酵生产酸性羧甲基纤维素酶的最适作用pH为6. 0 ;所述的发酵生产碱性 羧甲基纤维素酶的最适作用pH为8. 5。
[0013] 所述的碱性羧甲基纤维素酶的最适反应温度为60°C。
[0014] 本发明具有的突出的实质性特点和显著的进步是：
[0015] 本 申请人:从自然界中成功分离筛选出了一种能产β-1，4葡聚糖酶的新菌株，拓 宽了纤维素酶生产菌株的选择范围，有利于推进木质纤维素降解利用中纤维素酶的进一步 优化。本发明所提供的菌株为好氧的短杆状革兰氏阳性菌，直杆状，0. 6?0. 8 μ mX 1. 5? 2. 5 μ m。菌落大小2mm，透明有光泽，产浅棕色色素。菌株序列具有序列表1所示的核酸序 列，与一株 Providencia vermicola strain FFA6 的菌株（Genbank 登录号为 JN092794)的 序列相似度在99%以上。
[0016] 经试验证明，该菌株在有氧条件下，pH = 8,培养温度为30°C时生长最快。在LB培 养基中生长迅速进入对数期，在约24h进入稳定期，0D_达到1. 3,培养至72h开始衰退。最 佳产酶条件下酶活可达0. 15U/ml菌液。该酶在较广泛pH范围内（4. 0-10. 0)呈现β -1，4 葡聚糖酶（羧甲基纤维素酶）酶活，且主要呈现碱性纤维素酶活力。酸性CMC酶的最适作 用pH为6. 0,碱性CMC酶的最适作用pH为8. 5。酸性CMC酶活力约为碱性CMC酶活力的 75%。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图 1 为普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364最适生 长pH的测定结果。培养基采用LB培养基；培养条件：有氧条件下，30°C，200rpm摇瓶培养。
[0018] 图 2 为普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 最适生 长温度的测定结果。培养基采用LB培养基；培养条件：pH为7. 2, 200rpm摇瓶培养。
[0019] 图 3 为普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株生 长曲线测定结果。培养基采用LB培养基；培养条件：pH8. 0,30°C，200rpm摇瓶培养。
[0020] 图 4 为普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 产纤 维素酶的时间曲线测定结果。菌株用培养基（含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L，NaC15g/ L，KH2P04lg/L，MgS04 · 7H202g/L，121°C灭菌 20min，用预先灭菌的 10% (W/V)Na2C03 溶液调 pH至8. 0?9. 0)在30°C，200rpm下摇瓶培养，接种量5%，定时测定发酵菌纤维素酶活力。 CMC酶活力按QB2583-2003的方法测定，pH为8. 5,以lmin水解CMC-Na底物产生lumol的 葡萄糖残基为1个酶活单位。
[0021] 图 5 为普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株所 产纤维素酶的最适作用pH测定结果。pH3-6用柠檬酸盐缓冲液，pH7-8用Tris-HCl缓冲液， PH9-12使用Gly-NaOH缓冲液。缓冲液的浓度均为0. lmol/L。测定温度为42°C。以lmin 水解CMC-Na底物产生lumol的葡萄糖残基为1个酶活单位；
[0022] 图 6 为普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株所 产纤维素酶的最适作用温度测定结果。菌株用培养基（含蛋白胨5g/L，酵母抽提物5g/L， 恥(：158/1，腿 2?0418/1，]\%504.7!12028/1，1211：灭菌201^11，用预先灭菌的10%(^)似 2〇)3 溶液调pH至8. 0?9. 0)在30°C，200rpm下摇瓶培养64小时，接种量5%，然后取发酵菌液 按QB2583-2003的方法测定纤维素酶的CMC活力。以lmin水解CMC-Na底物产生lumol的 葡萄糖残基所需酶量为1个酶活单位；
[0023] 图 7 为普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株所 产纤维素酶的耐热性测定结果。反应pH为8. 5,保温时间为4h。
[0024] 图 8 为普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G CCTCC NO :M2013364 菌株所 产纤维素酶受常见金属离子影响测定结果。CK :对照，不加金属离子；金属离子浓度：0. 5%; 酶反应温度：50°C ;反应pH :8· 5。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1菌株筛选、分离与鉴定
[0026] 第一步：采样
[0027] 广西壮族自治区南宁市堆肥1cm深处采得样品。
[0028] 第二步：初筛、复筛及纯化
[0029] 取样品lg，加10ml无菌蒸馏水，充分振摇，静止30分钟，取上清液稀释105倍，涂 布接种CMC-刚果红平板筛选培养基，30°C培养72h至菌落长出，挑取透明水解圈较大的菌 落，接种CMC液体发酵培养基，37°C，200rpm摇瓶培养24h，测定培养液的碱性CMC酶活力。 选取活力最高的培养瓶，取菌液划线接种CMC-刚果红平板筛选培养基培养，纯化菌株3次， 最后得到1株产碱性纤维素酶的高产菌株，命名为6G，斜面和冷冻干燥保藏。
[0030] 第三步：菌种鉴定
[0031] 形态观察。LB培养基培养的菌体用革兰氏染色，显微镜观察可见直杆状革兰氏阳 性菌，0.6?0.8 μ mX 1.5?2.5 μ m。菌落大小2mm，透明有光泽，产浅棕色色素。如图1和 图2所示，菌株在有氧条件下，pH = 8,培养温度为30°C时生长最快。如图3所示，在LB培 养基中生长迅速进入对数期，在约48h进入稳定期，0D6(?达到1. 3。培养至72h开始衰退。
[0032] BI0L0G微生物鉴定系统的鉴定。用Biolog微生物鉴定系统进行。活化的菌株接 种BUG培养基，接种量5 %，33°C，200rpm培养24-48h，调整菌液浊度至5%，将菌液加入仪 器的GENIII96孔生化鉴定板，利用仪器的MicroStation读取鉴定板中各孔的颜色反应特 征值，通过ML3DC分析程序与数据库中细菌的生理生化数据进行匹配，根据6G菌株与数据 库菌株之间匹配的概率、相似性和位距对6G菌株进行鉴定。初步将6G鉴定为Providencia stuartii，其中，概率（Prob)为 0. 841，相似性（Sim)为 0. 740,距离（Dist)为 5. 448,结果 有一定的参考价值，即该菌株属于Providencia菌属。仍需结合分子鉴定结果进行分析。
[0033] 基于16s rDNA序列的分子鉴定。活化菌株接种LB培养基，接种量5%，37°C， 200rpm培养8h至对数期，菌数2X 108/mL以上。取培养液2mL，15000rpmX 10min离心， 弃上清液，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次，收集菌体细胞，使用天根细菌基因组DNA抽屉试剂 盒提取DNA。以该基因组DNA为模板，采用通用引物27F/1492R，PCR扩增菌株的16S rDNA 序列。50yL的反应体系含PCR缓冲液5yL，正、反向引物各lumol/L，Mg2+2. 5mmol/L， dNTPO. 02mmol/L，Taq DNA 聚合酶 1. 25U。反应条件为：95°C变性 5min ;94°C变性 30s ;55°C 退火30s ;72°C延伸lmin，30个循环，最后72°C延伸10min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检 测、分离，然后用Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒切胶回收，用T41igase连接到 PMD-18T载体上。将带有目的片段的载体通过转化E. coli DH5a菌株扩增培养后，选择阳 性克隆提取质粒交上海生工测序。将测序得到的16s rDNA序列用NCBI的BLAST2. 0进行 同源分析（Nucleotide-Nucleotide Blast)，搜索Genbank核酸数据库，根据比对结果对菌 株进行分子鉴定。结果与其中1株登录号为JN092794的Providencia vermicola strain FFA6菌株的相似度最高为99%，表明菌株6G为Providencia vermicola菌株。
[0034] 综合鉴定结果，分子鉴定的可信度优于BI0L0G鉴定结果。因此，最终将该菌株鉴 定为 Providencia vermicola。
[0035] 实施例2菌株产纤维素酶水平检测
[0036] 根据生长的最适温度和pH，将菌株6G接种CMC发酵培养基培养，绘制产酶曲线。 粗酶液制备方式为：活化菌株接种CMC发酵培养基，30°C，200rpm培养48h，取培养液，4°C下 4000rpm离心10min，取上清液，加55%的（順 4)2504沉淀，4°C，lOOOOrpm离心10min，收集沉 淀，加入培养液同体积的PH8. 0,0. lmol/L的Tris-HCl缓冲液溶解。以CMC钠盐为底物，测 定纤维素内切酶的活力，即CMC酶活力。酶反应体系含粗酶液0. 5ml，CMC钠盐1 %，0. lmol/ L的Tris-HCl (pH8. 0)缓冲液2. 0ml。50°C水浴反应60min，立刻用DNS法测定CMC水解所 释放的葡萄糖量。以作用CMC钠盐底物lmin释放lmg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活 力单位。
[0037] 结果如图4所示，结合图3的结果可知，该菌株在生长初期（对数期）中，产酶与 生长同步。16h时产酶达到最高值为0. 15U/mL，并在此后稳定的逐步降低。
[0038]将反应液的 pH用缓冲液调为 3· 0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0、9· 0、10· 0、11· 0 和 12. 0， 测定不同pH下的CMC酶活力，用百分比表示测定结果。所用缓冲液分别为：pH3-6用柠檬 酸盐缓冲液，PH7-8用Tris-HCl缓冲液，pH9-12使用Gly-NaOH缓冲液。缓冲液的浓度均为 0. lmol/L。结果如图5所示，可见该菌株所产的纤维素酶既有酸性CMC酶的活力，又有碱性 CMC酶的活力。酸性CMC酶的最适作用pH为6. 0,碱性CMC酶的最适作用pH为8. 5。酸性 CMC酶活力为碱性CMC酶活力的75 %。
[0039] 依据以上方法分别测定酶液的最适作用温度、耐热能力和金属离子对酶液的作 用，结果分别如图6-图8所示。从图6可知，菌株所产碱性CMC酶活力的最适作用温度 为60°C，温度低于55°C或高于65°C时酶活力均迅速下降，可见该酶液的作用温度范围非常 窄。通过将酶液在50°C下保温测定酶液的耐热能力，结果如图7所示，可见酶活呈线性下 降，保温lh酶活力下降超过35%，保温3h残留酶活只有15 %，而保温4h酶活残留几乎为 〇,表明该菌株所产的碱性纤维素内切酶的热稳定性较差。在测定酶活力时加入〇. 5%的各 种金属离子，观察金属离子对菌株1A所产碱性CMC酶活力的影响，结果如图8所示，Mg2+对 酶活具有显著的促进作用（+17%)。Ca 2+、C〇2+和Mn2+等3种离子对酶活有促进，分别使酶 活力提高4. 5%、6· 7%和6.3%。Na+对酶的活力几乎没有影响。K+、Ni+两种离子对酶活力 稍有抑制，加入酶反应体系后分别使酶活力降低了 6.7% (K+)，4.6% (Ni+)。而Fe2+、Cu2+对 菌株所产碱性CMC酶具有明显的抑制作用，分别使酶活力降低了 20%和89%。
【权利要求】
1. 一种普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G菌株，其保藏编号为：CCTCC N0:M2013364〇
2. 权利要求1所述的普罗维登斯菌属（Providencia vermicola)6G在发酵生产羧甲基 纤维素酶以及制备降解纤维素的生物酶制剂上的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵生产羧甲基纤维素酶包括酸 性羧甲基纤维素酶和碱性羧甲基纤维素酶。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的酸性羧甲基纤维素酶的作用pH为 6. 0 ;所述的碱性羧甲基纤维素酶的作用pH为8. 5。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的碱性羧甲基纤维素酶的反应温度 为 60。。。
【文档编号】C12N9/42GK104232523SQ201410432165
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】芦志龙, 陈东, 张穗生, 吴仁智, 陆琦, 黄日波 申请人:广西科学院