景天根际铅抗性菌株普罗维登斯菌,筛选方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株从景天根际分离的铅抗性菌株普罗维登斯菌（Providencia sp.) BPb7及其在植物-微生物联合修复铅重金属污染土壤中的应用。
【背景技术】
[0002] 土壤是人类获取食物和其它再生资源的物质基础，是人类赖以生存的自然环境和 农业生产的重要资源。
[0003] 环境污染物的排放量与日俱增，环境污染和生态破坏给土壤带来了严重的污染， 其中重金属污染的面积在不断增加，这不仅退化土壤肥力，降低农产品的产量和品质，而且 恶化水环境，并通过食物链危及人类的生命健康。据粗略统计，过去50年中全球排放到环 境中的铅，达到7. 83 X IO5吨。目前，全球平均每天排放铅约500万吨，其中有相当部分进入 了土壤，从而使部分地区的土壤遭到污染，破坏了生态系统的正常功能，也对人体健康造成 了危害。铅在人体内和蛋白质及各种酶发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人 体的某些器官中累积，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性中毒、亚急性中毒、 慢性中毒等危害。对重金属污染土壤的治理和修复是一项十分紧迫的任务。
[0004] 20世纪90年代以后，许多学者注意到了植物和微生物共存体系对重金属超积累 的重要性，植物根系-微生物系统的相互促进作用将是提高污染土壤生物修复能力的一个 活跃领域。微生物是土壤的重要组成部分，参与土壤生态系统的物质循环与能量转换过程， 对提高土壤肥力和维持土壤生态平衡具有重要意义。在污染土壤中接种微生物能够促进 植物对营养元素与重金属的吸收，同时微生物能够分泌一些生长调节剂和保护植物的抗生 素、抑菌剂和螯合剂等，这些物质都能增强植物对环境的适应能力。
[0005] 因此，分离具有较强铅耐受性和促进植物修复铅污染土壤的细菌对植物-微生物 联合修复铅重金属污染土壤具有现实意义和重要的工程应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的技术目的在于筛选景天根际具有较强铅耐受性的细菌。
[0007] 因此，本发明的第一方面涉及一株从景天根际分离的铅抗性菌株普罗维登斯菌 (Providencia sp.)BPb7,其于2014年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10085。
[0008] 优选地，所述景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7的16S rDNA基因序列如 SEQ ID NO :3所示，GenBank数据库中没有与其一致的序列，且本菌株16S rDNA基因序列并 未提交GenBank数据库。
[0009] 本发明的第二方面涉及上述的景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7的筛选 方法，其包括步骤：
[0010] (1)选择生长状况良好的景天植株进行处理：取铅（Pb)溶液母液2. 5ml，稀释定容 至40ml，均匀浇灌在生长供试植物的土壤中，使土壤的铅含量达到1000 mg · kg'在胁迫的 条件下继续培养30d，每间隔4d浇水40ml ;
[0011] (2)菌种的分离、纯化与筛选：在经过处理的植物根际取IOg 土样，置于90ml装有 玻璃珠的细菌培养基中，在37°C恒温振荡器上150X g振荡20-30min后取下，静止5min，使 土壤沉淀；在沉淀以上的各个层面进行多次取样，接入新的细菌培养基中，37°C培养24h ; 取富集后的菌悬液，用倍数稀释法将其涂布于筛选培养基的平板上，倒置于37°C恒温培养 箱中，培养48h ;肉眼观察，分别挑选不同形态的典型单菌落，在培养皿底做好标记，并挑取 单菌落在新的筛选培养基上划线分离；反复进行以上步骤，直至得到菌落特征一致的纯菌 种；
[0012] (3)对于筛选出的已纯化菌种进行保存：将分离纯化得到的菌种接种于细菌培养 基，培养后加入60% (v/v)甘油，使甘油的终浓度为10% (v/v)，置于-80°C进行保存。
[0013] 其中所述细菌培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH7. 0 ;
[0014] 所述筛选培养基的配制方法如下：基础培养基为细菌培养基1000ml，添加微量元 素液和维生素液各l〇ml，121 °C灭菌20min，冷却至70°C，加入铅溶液母液，使培养基中铅含 量为 1000 mg · L-1，37°C 培养。
[0015] 其中微量元素液为：MnSO4O. Olg，ZnSO40.0 5g，H3BO3O. Olg，CaCl2O. Olg，定容至 1L， 4°C避光保存；维生素液为：肌酸0. 025g，抗坏血酸0. 025g，核黄素0. 025g，柠檬酸0. 02g， 定容至1L，4°C避光保存；铅溶液母液为：Pb (CH3COOH) 2 ·3Η20配制成Pb2+浓度为200mg ·πι1 η 的母液，过滤除菌后，室温保存。
[0016] 本发明的第三方面涉及含有上述的景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7的 组合物。
[0017] 优选地，所述组合物具有较强的铅耐受性。
[0018] 本发明的第四方面涉及上述的景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7及所述 组合物在植物-微生物联合修复铅重金属污染土壤中的用途。
[0019] 本发明的第五方面涉及上述的景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7及所述 组合物在处理含重金属铅的污染物中的用途。优选地，所述污染物为被污染的土壤。
[0020] 利用本发明的筛选方法从铅胁迫的景天植物根际土壤中分离筛选出的铅抗性菌 株Providencia sp.BPb7,其于2014年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所， 保藏编号为CGMCC No. 10085;其建议的分类命名为普罗维登斯菌属Providencia sp.;其 为革兰氏阴性菌，需氧杆菌，无鞭毛、无荚膜。该菌株对重金属铅有较强的耐性，对植物-微 生物联合修复铅重金属污染土壤具有现实意义和重要的工程应用价值。
[0021] 本领域技术人员公知，在本发明所获得的上述景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7新种的基础上，本领域技术人员可以对所述细菌进行适当的诱变而继续提高其耐 受重金属铅的能力，这样的诱变后的基于本发明所述菌种的突变株也落入本发明保护的范 围。所述诱变包括辐射、化学诱变等。同时，本领域技术人员也可能将本发明获得的上述菌 株与其他植物共同使用，以达到最佳植物-微生物联合修复重金属铅污染土壤的目的。
【附图说明】
[0022] 图 1 :菌株 Providencia sp. BPb7 的 16S rDNA 序列。
[0023] 图2 :菌株Providencia sp. BPb7的透射电镜照片。
[0024] 图 3 :菌株 Providencia sp. BPb7 生长曲线图。
【具体实施方式】
[0025] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不 背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0026] 下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均 可容易地从商业公司获取。
[0027] 实施例
[0028] 实施例1景天根际铅抗性菌株Providencia sp. BPb7的分离
[0029] 材料与方法
[0030] 1、培养基
[0031] 细菌培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水lOOOmL，pH7. 0。
[0032] 配制筛选培养基：基础培养基为细菌培养基1000ml，添加微量元素液和维生素 液各10mL，121°C灭菌20min，冷却至70°C左右，加入铅溶液母液，使培养基中铅含量为 1000 mg · ΙΛ37°C培养。
[0033] 其中微量元素液为：MnSO40.0 1g，ZnSO40.0 5g，H3BO30.0 1g，CaCl20.0 1g，定容至 1L， 4°C避光保存。维生素液为：肌酸0. 025g，抗坏血酸0. 025g，核黄素0. 025g，柠檬酸0. 02g， 定容至1L，4°C避光保存。铅溶液母液：Pb (CH3COOH) 2 · 3H20配制成Pb2+浓度为200mg · mL 一1的母液，过滤除菌后，室温保存。
[0034] 2、样品采集和菌株分离
[0035] 选择生长状况良好的景天植株进行处理。取重金属Pb溶液母液2. 5mL，稀释定容 至40mL，均匀浇灌在供试植物的土壤中，使土壤的铅含量达到1000 mg *kg'在胁迫的条件 下继续培养30d，每间隔4d浇水40mL。在经过处理的植物根际取IOg 土样，置于90mL装有 玻璃珠的细菌培养基中，在37°C恒温振荡器上150X g振荡20-30min后取下，静止5min，使 土壤沉淀。在沉淀以上的各个层面进行多次取样，接入新的细菌培养基中，37°C培养24h。取 富集培养后的菌悬液，用倍数稀释法将其涂布于筛选培养基的平板上，倒置于37°C恒温培 养箱中，培养48h。肉眼观察，分别挑选不同形态的典型单菌落，在培养皿底做好标记，并挑 取单菌落在新的筛选培养基上划线分离。反复进行以上步骤，直至得到菌落特征一致的纯 菌种，至此完成菌种的分离、纯化与筛选工作。对于筛选出的已纯化菌种进行保存：将分离 纯化得到的菌种接种于细菌培养基，培养后加入60% (v/v)甘油，使甘油的终浓度为10% (v/v)，置于_80°C进行保存。分离获得一株对重金属铅有较强的耐性的细菌，命名为BPb7。
[0036] 实施例2菌株BPb7的菌种鉴定
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