、基因组DNA提取
[0038] 按照常规技术手段大量培养上述菌株BPb7,然后获取其基因组DNA。
[0039] 2、菌株BPb7的16S rDNA的鉴定方法
[0040] 2. 1菌株BPb7的16S rDNA的PCR扩增、测序及系统发育树的构建
[0041] 2. I. 116S rDNA基因序列的PCR扩增
[0042] 扩增16S rDNA基因序列的两端引物选用通用引物：正向引物BSF8/20 : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（SEQ ID N0:1)和反向引物BSR1541/20: 5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' (SEQ ID NO :2)。PCR 反应体系为 50 μ L，反应条件为 94°C 变性51^11;接下来进行35个循环反应：94°0变性458,50°0退火458,72°0延伸9〇8 ;然后 72°C再延伸lOmin，最后于4°C保存。
[0043] 2. 1. 2扩增产物的克隆及序列测定
[0044] PCR产物用TAKARA公司生产的pMD?18-T Vector克隆试剂盒进行克隆，先将 163扣嫩基因片段纯化，连接到丨)1*|40@丨8-丁￥6〇1:〇1'载体上，5以1^连接反应液转化感受态 细胞DH5 α，并用菌落PCR进行鉴定。重组子的基因序列由上海生工生物工程技术服务有限 公司测定。
[0045] 2. 2菌株BPb7的16S rDNA的鉴定结果
[0046] 2. 2. 1 菌株 BPb7 的 16S rDNA 基因序列
[0047] 扩增菌株BPb7的16S rDNA基因序列，得到了长度约I. 5kb的扩增片段。扩增片 段经胶回收、连接、克隆后测序，测得菌株BPb7的16S rDNA为1624bp(SEQ ID N0:3,同时 请见图1)，该序列未提交NCBI数据库。
[0048] 2. 2. 2BPb716S rDNA基因序列的相似性比较
[0049] 将BPb716S rDNA的序列输入到NCBI数据库中，运用Blast程序将这株细菌的16S rDNA和数据库中的16S rDNA基因序列进行比对，从数据库中挑选与BPb7的16S rDNA基因 序列具有较高相似性的菌株，见表1。
[0050] 从表 1 中可以得出，菌株 BPb7 的 16S rDNA 与和 Providencia vermicola strain FFA6、Providencia vermicola strain CICR-SPBB、Providencia vermicola strain OPl、 Enterobacteriaceae bacterium MB6-1 和 Providencia sp.XW16 菌株的相似性都比较高， 均可以达到99%以上，且多数为Providencia属的成员。这说明菌株BPb7为Providencia vermicola的一个新亚种。
[0051] 表1菌株BPb716S rDNA序列NCBI同源性检索结果
[0052]
[0053] 3.菌株 Providencia sp. BPb7 生理生化分析
[0054] 3. 1形态特征
[0055] 米用日本日立公司H-7650型号透射电子显微镜对菌株BPb7进行了电镜观 察。该透射电镜分辨率为〇. 2nm，加速电压为40kV~120kV，放大倍率（连续放大模式 为X200~X600000 ;低倍模式为X50~X1000)。菌株BPb7的透射电镜观察照片见 图2。菌株BPb7呈革兰氏染色阴性，需氧杆菌，有菌毛、无荚膜，直径约0. 6 μπι，长度约 L 3-1. 8 μ m，其菌落的形态特征见表2。
[0056] 表2 BPb7菌株菌落的形态特征
[0057]
[0058] 3. 2生理生化分析
[0059] 对菌株BPb7进行了生理生化分析，其分析结果见表3。糖酵解试验分析结果见表 4〇
[0060] 表3 Providencia sp. BPb7的生理生化试验分析
[0061]
[0062；
[0063] 注：" + "阴性阴性
[0064] 表 4 Providencia sp. BPb7 的糖酵解分析
[0065]
[0066] 注：" + "表示产酸，"一"表示不产酸。
[0067] 3. 3Providencia sp. BPb7 生长曲线
[0068] 将Providencia sp. BPb7菌株接种于LB液体培养基中活化24h，取500 μ L接种 于IOOmLLB液体培养基中，将三角瓶置于37°C恒温振荡器150 Xg进行培养。每隔2h取样 一次，以未接菌的LB液体培养基为空白对照，用分光光度计比色法测定600nm波长下细菌 悬浮液的吸光值，连续测定36h。以培养时间为横坐标，0D600为纵坐标，绘制细菌生长曲线 (见图3)。
[0069] 从图3可知，菌株BPb7从接种后4小时内处于迟缓期，4-22小时为对数生长期，22 小时后进入平台期。
[0070] 4. Providencia sp. BPb7菌株促进景天吸收重金属铅的能力
[0071] 通过菌剂盆栽实验测定菌株对植物吸收铅的促进作用。实验结果如表5所示。
[0072] 表5不同铅浓度处理对景天叶片铅含量的影响
[0073]
[0074] 从表5可以看出，在景天根部添加了 JPb5菌剂后，植株对铅的吸收量明显增加。在 不同的铅处理浓度（200,400,600,800,1000mg/kg'下，投加 BPb7菌剂后，景天植物叶片铅 含量均比未投加时高，分别提高铅含量百分比为1. 6 %，4. 82 %，3. 66 %，4. 81 %，15. 16 %。 说明BPb7菌剂可以提高景天吸收铅的能力。
[0075] 景天根际铅抗性菌株或含有景天根际铅抗性菌株的组合物在处理含重金属铅的 污染物或植物-微生物联合修复铅重金属污染土壤中的应用。
[0076]
[0077]
[0078]
【主权项】
1. 一株景天根际铅抗性菌株普罗维登斯菌（5/7.)其于2014年 12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10085。2. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。3. 根据权利要求1或2所述的景天根际铅抗性菌株的筛选方法，其包括步骤： (1) 选择生长状况良好的景天植株进行处理：取铅（Pb)溶液母液2. 5ml，稀释定容至 40ml，均匀浇灌在生长供试植物的土壤中，使土壤的铅含量达到1000 mg ? kg_1;在胁迫的条 件下继续培养30d，每间隔4d浇水40ml ; (2) 菌种的分离、纯化与筛选：在经过处理的植物根际取IOg 土样，置于90ml装有玻璃 珠的细菌培养基中，在37°C恒温振荡器上振荡20-30min后取下，静止5min，使土壤沉淀； 在沉淀以上的各个层面进行多次取样，接入新的细菌培养基中，37°C培养24h;取富集后的 菌悬液，用倍数稀释法将其涂布于筛选培养基的平板上，倒置于37°C恒温培养箱中，培养 48h;肉眼观察，分别挑选不同形态的典型单菌落，在培养皿底做好标记，并挑取单菌落在新 的筛选培养基上划线分离；反复进行以上步骤，直至得到菌落特征一致的纯菌种； (3) 对于筛选出的已纯化菌种进行保存：将分离纯化得到的菌种接种于细菌培养基，培 养后加入60% (v/v)甘油，使甘油的终浓度为10% (v/v)，置于-80°C进行保存； 其中所述细菌培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水lOOOmL，pH7. 0 ; 所述筛选培养基的配制方法如下：取所述细菌培养基l〇〇〇ml，添加微量元素液和维 生素液各l〇ml，121°C灭菌20min，冷却至70°C，加入铅溶液母液，使培养基中铅含量为 1000 mg ? L'37°C培养； 其中所述微量元素液为：MnSO4 0? 01g，ZnSO4 0? 05g，H3BO3 0? 01g，CaCl2 0? 01g，定 容至1L，4°C避光保存；所述维生素液为：肌酸0. 025g，抗坏血酸0. 025g，核黄素0. 025g， 柠檬酸0. 02g，定容至1L，4°C避光保存；所述铅溶液母液为：Pb(CH3COOH)2 ? 3H20配制成 Pb2+浓度为200mg ? ml 的母液，过滤除菌后，室温保存。4. 一种含有权利要求1或2所述的景天根际铅抗性菌株的组合物。5. 根据权利要求1或2所述的景天根际铅抗性菌株或权利要求4所述组合物在处理含 重金属铅的污染物或植物-微生物联合修复铅重金属污染土壤中的用途。
【专利摘要】本发明涉及景天根际铅抗性菌株普罗维登斯菌（Providencia sp.）BPb7。具体而言，本发明涉及一株从景天根际分离的铅抗性菌株Providencia sp.BPb7，其于2014年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.10085。其为革兰氏阴性菌，需氧杆菌，有菌毛、无荚膜。该菌株对重金属铅有较强的耐性，对植物-微生物联合修复铅重金属污染土壤具有现实意义和重要的工程应用价值。CGMCC No.1008520141201
【IPC分类】C12N1/20, B09C1/10, C12R1/01
【公开号】CN104974959
【申请号】CN201510397878
【发明人】林海龙, 范阳, 冯晶石, 田宇哲, 李德斌
【申请人】中国长江三峡集团公司, 中国水利电力对外公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月8日