一种人脐带间充质干细胞源外泌体及其获取方法和应用与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞源外泌体及其获取方法和应用。

背景技术：

msc(mesenchymalstemcell)即间充质干细胞是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。

由于不能适应体内的环境，体外培养的人间充质干细胞(msc)无论通过何种途径进入体内，如静脉输注、局部骨骼肌注射、脑组织注射或骨缺损组织移植等，多数细胞在短期内死亡。那么，死亡的细胞又是如何发挥作用的呢？近年来的研究表明，在低氧及低营养条件下，msc可以释放大量的膜微粒(membranemicroparticles，mp)。这些mp包括因细胞凋亡而形成的凋亡小体(apoptoticbodies)，通过发芽形式释放的膜微囊(membranemicrovesicles，mv)，以及通过内质体主动释放的外泌体(exosomes)。

三种膜微粒中，凋亡小体最大，一般直径在1μm左右，其中富含基因组dna。膜微囊大小不均一，直径在100nm至1μm之间，其表面负载着来源细胞特征性的分子。外泌体大小均一，其直径一般为50-200nm，其表面有内质体特征性的分子，如cd9，cd63和cd81。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术在外泌体技术空白瓶颈，从而提出一种人脐带间充质干细胞源外泌体及其获取方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明公开了一种人脐带间充质干细胞源外泌体，所述外泌体的外膜为磷脂双层结构，所述外泌体内部含有micro-rna、所述外泌体源细胞的mrna、dna和核酸中的至少一种。

本发明还公开了所述外泌体的制备方法，步骤如下：

a)对人间充质干细胞进行培养，培养阶段在细胞培养基中添加干扰素、epo和pdgf-bb；

b)对培养后的干细胞进行预处理；

c)在预处理后的培养基的上清液中提取所述人脐带间充质干细胞源外泌体。

优选的，所述外泌体为msc分化而来。

优选的，所述人脐带间充质干细胞源为人脐带间充质干细胞。

优选的，所述预处理的具体步骤为：

1)将人传代人脐带间充质干细胞源进行无血清悬浮培养，并调整细胞浓度为1.0×10⁶/ml；

2)按照10⁶/150mm大培养皿接种，培养至细胞融合度至70-80％，培养时间为2-3天；

3)吸除培养皿中的液体，并用alpha-mem液体培养基对培养皿进行洗涤；

4)在150mm培养皿中再次加入20ml的alpha-mem；

5)依次加入重组人干扰素、pdgf-bb和epo；

6)在37℃，5％的co2条件下培养96小时，收集得到人脐带间充质干细胞源培养液。

优选的，所述步骤a)的步骤5)具体为：首先加入重组人干扰素、pdgf-bb，在37℃，5％的co2条件下培养24小时；然后，再加入epo，在37℃，5％的co2条件下培养72小时。

优选的，所述人脐带间充质干细胞源培养液中干扰素的浓度为10u/ml～600u/ml、pdgf-bb的浓度为2ng/ml～60ng/ml，epo的浓度为0.1iu/ml～5iu/ml。

优选的，所述步骤b)的具体为：

1)取所述人脐带间充质干细胞源培养液的上清液，进行离心处理，去除细胞碎片；

2)然后将上清液滤膜过滤处理，去除凋亡小体，得到预处理后的上清液。

优选的，所述步骤c)具体为：

1)取容积为5体积份的离心管，加入1体积份的外泌体分离试剂；

2)加入4体积份的经过预处理后的上清液，充分混匀；

3)静置处理后，再进行两次离心处理，得到所述外泌体。

优选的，所述外泌体在美容制剂的制备领域中的应用。

优选的，任一项所述获取方法在制备外泌体美容制剂中的应用。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明所得外泌体可以进入内皮细胞，进而促进内皮细胞的增殖和管网结构形成，可以作为护肤美容制品的活性成分，具有极大的市场前景和应用价值。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是实施例中所述外泌体的电镜分析示意图；

图2是实施例中对所得外泌体进行流式细胞仪分析的结果图；

图3是实施例中对外泌体进行普通光镜观察的结果示意图；

图4是实施例中对外泌体进行荧光显微镜观察的结果示意图；

图5是实施例中所得外泌体的内皮细胞增殖试验的流式细胞仪分析结果；

图6是实施例中胎牛血清的流式细胞仪分析结果；

图7-1是实施例中dmem培养基组的管网结构数量图；

图7-2是实施例中1μg/ml外泌体组的管网结构数量图；

图7-3是实施例中10μg/ml外泌体组的管网结构数量图；

图7-4是实施例中50μg/ml外泌体组的管网结构数量图；

图7-5是实施例中100μg/ml外泌体组的管网结构数量图；

图7-6是实施例中b-成纤维细胞生长因子组的管网结构数量图；

图8是实施例中各接种组的数量对比柱状图。

具体实施方式

实施例1本实施例公开了一种人脐带间充质干细胞源外泌体，所述外泌体的外膜为磷脂双层结构，所述外泌体内部含有micro-rna、所述外泌体源细胞的mrna、dna和核酸。

实施例2本实施例公开了实施例1所述外泌体的整个制备流程：

一、人脐带间充质干细胞源的培养及预处理

1.材料及试剂

1)人脐带、胎盘、骨髓、脂肪或其它来源的msc，传代次数在6代以内均可。

2)人脐带间充质干细胞源无血清培养基

3)alpha-mem

4)重组人干扰素

5)重组人epo

6)重组人pdgf-bb

7)培养皿(直径150mm)

8)其它耗材

二、细胞培养

1)将人传代msc消化后计数，使用msc无血清完全培养基悬浮，调整细胞浓度为1.0×10⁶/ml。

2)按照10⁶/150mm大培养皿接种，培养至细胞融合度至70-80％。一般需要2-3天。

3)吸除培养皿中的液体，并用alpha-mem液体培养基对培养皿进行洗涤。

4)加入alpha-mem20ml/150mm培养皿。

5)首先，加入重组人干扰素、pdgf-bb，在37℃，5％的co2条件下培养24小时；然后，再加入epo，在37℃，5％的co2条件下培养72小时；重组人干扰素(终浓度为10u/ml～600u/ml)、pdgf-bb(2ng/ml～60ng/ml)及epo(0.1iu/ml～5iu/ml)。

6)37℃，5％co2条件下培养96小时。

7)收集上清进行以下处理。如不能及时处理，将上清置于-80℃保存。

三、人msc培养上清的预处理

1.材料与试剂

1)离心管等耗材。

2)孔径为1μm，0.45μm及0.22μm的滤器。

2.操作步骤

1)收集细胞培养上清，室温或4℃条件下离心2000g，10分钟，去除细胞碎片。

2)将培养上清或体液分别经过直径为1μm，0.45μm及0.22μm滤膜过滤，以去除其中可能存在的凋亡小体。

四、外泌体的收获

1)取50ml离心管，加入外泌体分离试剂10ml。或取250ml离心管，加入外泌体试剂50ml。

2)加入经过处理的细胞培养上清40ml，充分混匀。或加入培养上清200ml。

3)置于4℃过夜，或至少6小时。

4)离心，2000g，30分钟。

5)移除液体，再次离心，2000g，5分钟。

6)用pipette小心吸除残留液体。

7)加入pbs或生理盐水500μl至1ml。或加入pbs或生理盐水2.5ml至5ml。

8)测定蛋白质浓度，或进行流式细胞学等仪器分析。

9)分装，在-20℃温度下保存。

实验例

实验例1所得外泌体的电镜观察

采用常规方法，对所得外泌体进行电镜分析，结果如下图01所示。

图01所得外泌体的电镜观察结果

电镜观察结果表明，所得外泌体的直径约为100nm。

实验例2所得外泌体的流式细胞仪分析

采用常规方法，对所得外泌体进行流式细胞仪分析，结果如下图02所示。

图02所得外泌体的流式细胞仪分析结果

流式细胞仪分析结果表明，所得外泌体大量表达cd29和cd73，但不表达cd31和cd45。这证明了所得外泌体来源于人脐带干细胞。

实验例3所得外泌体的内皮细胞吞噬试验

利用细胞膜标记燃料di-i标记起始原料，即人脐带干细胞，重复实验一、实验二、实验三，获取di-i标记的外泌体。然后采用常规方法，将所得外泌体与内皮细胞共培养。最后，进行普通光镜观察(结果见图3)和荧光显微镜观察(结果见图4)和流式细胞仪分析(结果见图5)，从图3、图4、图5可以发现，所得外泌体可迅速被内皮细胞吞噬，在8小时后几乎所有内皮细胞均变为di-i阳性。这说明了，所得外泌体具有促进内皮细胞增殖的基本性质。

实验例4所得外泌体的内皮细胞增殖试验

采用常规方法，取得内皮细胞样本，经细胞染色试剂cfse标记后，在六种不同条件下培养72小时以后，收集细胞进行流式细胞仪分析。具体的培养条件分别是：1μg/ml外泌体、10μg/ml外泌体、50μg/ml外泌体、100μg/ml外泌体、5％胎牛血清、10％胎牛血清。进行流式细胞仪分析，结果如图6(所得外泌体的内皮细胞增殖试验的流式细胞仪分析结果)、图7(胎牛血清的流式细胞仪分析结果)所示。

从图6可以发现，虽然三个样品的内皮细胞增殖速率不同，但所得外泌体对内皮细胞的促生长作用是一致的，其浓度为10μg/ml时即可发挥明显的效果，浓度达到100μg/ml时内皮细胞的增殖速度接近于10％胎牛血清的培养条件。这说明了，所得外泌体可明显促进内皮细胞增殖。

实验例5所得外泌体的内皮细胞管网结构形成试验

采用常规方法，将脐带内皮细胞接种于matrigel中，体系中加入不同成分(包括：dmem培养基、1μg/ml外泌体、10μg/ml外泌体、50μg/ml外泌体、100μg/ml外泌体、b-成纤维细胞生长因子)，24小时后计管网结构数量。结果依次为图7-1、为图7-2、为图7-3、为图7-4、为图7-5、为图7-6所示。统计了各个浓度的数量，做出了图8，各接种组的数量对比柱状图，可以发现，所得外泌体具有促进内皮细胞管状结构形成的作用，并呈浓度依赖性。

综合试验结果表明，所得外泌体可以进入内皮细胞，进而促进内皮细胞的增殖和管网结构形成。这证明了，所得外泌体可以作为一种活性成分，应用于护肤美容制品。

发明人通过多次试验发现，采用甘露醇作为冷冻保护剂，可以很好地保持人间充质干细胞源外泌体的形态和生物活性，而且具有良好的长期稳定性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。