一种治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法，所述干细胞制剂由混匀于生理盐水的骨髓多潜能干细胞、骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞和脂肪干细胞按照1:1:1的比例组成。本发明干细胞制剂所用细胞具有多向分化潜能和高增殖特性，来源丰富，取材方便，取材容易，对机体损伤小，容易进行体外分离、培养和诱导操作，将为细胞治疗糖尿病提供丰富的细胞来源，可在临床上大规模使用。本发明干细胞制剂植入体内无免疫排斥反应。本发明干细胞制剂制备方法使用特定的诱导培养体系，体外使骨髓多潜能干细胞定向分化为胰岛样细胞，解决了在糖尿病持续高血糖状态下植入的细胞很难分化为可分泌胰岛素的细胞困境。
【专利说明】一种治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法，属于干细胞再生医学技 术领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病（diabetesmellitus，DM)是一组以长期血葡萄糖（简称血糖）水平增高 为特征的代谢疾病群，是由遗传因素与环境因素共同作用引起的一种慢性高血糖态。它是 由于胰岛素分泌绝对和相对不足，导致糖代谢的紊乱，使血糖过高，出现糖尿。主要表现为 多饮、多食、多尿、消瘦等症状。随着人口老龄化进程的加速，人民生活水平的提高，生活方 式的改变，使得糖尿病的发病率迅速升高。近年来流行病学研究显示目前我国糖尿病的患 病率在4%左右，糖尿病已经成为了仅次于心脑血管疾病和肿瘤之后的第三位威胁人类健 康的慢性疾病，具有高致死率、高致残率和高医疗花费的特征，成为当前世界各国共同面对 的公共健康问题。
[0003] 目前，临床上主要采用口服降糖药及皮下注射胰岛素治疗糖尿病，主要解决的是 控制血糖，均不能从根本上治疗糖尿病。药物治疗是长年服用降糖药，只是把血糖高这一现 象消除了，但并未改变糖尿病的根本问题，也就是胰岛细胞功能低下的问题，长此以往，不 但病没治好，还会出现诸多并发症，降低患者的生活质量，缩短患者的寿命；而长期使用外 源性胰岛素注射既不能精确调节体内血糖水平，也不能阻止糖尿病并发症的发生，而且往 往最终会造成患者血小板降低、骨质疏松、血压升高和对胰岛素依赖等副作用。胰岛移植是 治疗糖尿病的有效方法之一。但是由于移植物质量和数量的限制、免疫排斥反应等难题限 制了该项技术在临床的应用。因此，各国学者在不断地探索并寻找出更好的非药物或非胰 岛素的治疗方案，以此来提高糖尿病患者的治疗效果。
[0004] 干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类 型的、高度分化的子代细胞。根据其分化潜能分为全能干细胞、多能干细胞和定向干细胞。 近年来，干细胞技术飞速发展，其在糖尿病治疗中的基础研究和临床应用也得以迅速开展， 干细胞研究给糖尿病患者带来新的希望，诱导干细胞分化为胰岛细胞成为新的发展方向之 一。胰岛3细胞是人体胰岛素分泌的主流细胞，干细胞会在胰腺组织微环境的诱导下分化 增殖为胰岛样细胞，替代损伤的胰岛0细胞分泌胰岛素，重建胰岛内分泌功能。
[0005] 人们希望寻找到来源丰富、容易获得的细胞来治疗糖尿病。骨髓多潜能干细胞是 来源于骨髓的单胚层多能干细胞，因其取材容易，具有支持造血、调节免疫的生理功能及以 下生物学特性：①具有较强的增殖能力，能自我更新；②具有多向分化潜能，具有明显的可 塑性，在体内可向多种骨髓间充质以外组织迁移定位并分化为相应的组织细胞；③免疫原 性弱，可移植并安全；④具有归巢性，所以可能作为运载工具定向运送生物制剂来治疗某些 疾病。因此，骨髓多潜能干细胞具有一个广阔的研究领域，有望被用在细胞疗法治疗中。骨 髓多潜能干细胞进入新环境后，对新环境的调节信号做出反应，分化成与新的生长环境相 适应的细胞。胰岛细胞合成分泌的多种细胞营养因子如胰岛素、胰高血糖素、葡萄糖转运子 2及pdx-1等，以及多种细胞外基质成分、细胞黏附因子和细胞间的相互作用均在间充质 干细胞的定向分化成胰岛样细胞上起着重要作用。
[0006] 骨髓多潜能干细胞及其诱导分化的胰岛细胞在自然情况下，可以参与内胚层来源 的组织一胰腺的生理更新和损伤修复。生理情况下，胰腺更新少、慢，主要由骨髓多潜能干 细胞补充病理损伤时，自体骨髓多潜能干细胞可随血液循环到达损伤的胰腺，并且转化为 胰岛0细胞，参与病理修复。
[0007] 干细胞移植技术为糖尿病及其并发症的治疗带来了新的希望。然而，受局部微环 境高糖、缺氧、营养缺乏等因素的影响，移植的干细胞常常大量凋亡或坏死，而少量残留干 细胞不能持续分泌足够的促血管生成因子，导致糖尿病血管病变的治疗效果受限。因此，如 何提高干细胞的存活率，成为干细胞移植治疗糖尿病及其相关并发症亟待解决的难题。
[0008] 脂肪组织与骨髓一样在发育过程中都来自于胚胎中胚层，并且都含有支持成熟组 织的基质成分。脂肪干细胞也是一种多向分化的干细胞，并发现它能够分化为脂肪、骨、软 骨、肌肉、血管内皮、肝、胰、神经等细胞系类型，具有易获得、易扩增、不易衰老等特点。月旨 肪干细胞具有以下优点：1.取材方便，对供区影响小，并发症少；2.分离培养简单，容易获 得，增值能力强，细胞移植不需在体外长期培养扩增；3.来源相对充足；4.在诱导因子作用 下具有定向分化能力；5.组织相容性好，能适应体内环境，保持良好的生物学特性且不引 起免疫排斥反应等。近年来，大量的研究表明脂肪干细胞可以产生和分泌多种促血管化的 细胞因子（如VEGF、HGF、bFGF等），并参与了组织损伤修复的血管化过程，并具有造血支 持作用、抗凋亡作用、趋化作用等。在干细胞移植中添加脂肪干细胞，可以增加移植干细胞 的存活率，对提高干细胞治疗糖尿病及其相关并发症的疗效具有重要意义。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供一种治疗糖尿病的干细胞制剂及 其制备方法，克服目前糖尿病治疗方法的缺点，以弥补作为胰岛移植治疗中胰岛细胞来源 的胰岛供体数量不足的局面。
[0010] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现： 一种治疗糖尿病的干细胞制剂，具体包括以下组分： a、 混匀于生理盐水的浓度为1X107?1X108个/ml骨髓多潜能干细胞悬液1份； b、 混匀于生理盐水的浓度为1X107?1X108个/ml骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞 悬液1份； c、 混匀于生理盐水的浓度为1X107?1X108个/ml脂肪干细胞悬液1份。
[0011] 进一步的，所述的生理盐水中添加了是含有寡糖、白蛋白、胆固醇、氯化钠、丙二醇 和碳酸氢铵，各成分浓度为 50g/L、50g/L、0. 3g/L、9g/L、5%、20g/L。
[0012] 一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤： 步骤1)生理盐水的制备：首先配制生理盐水，然后添加寡糖、白蛋白、胆固醇、氯化钠、 丙二醇和碳酸氢铵，使其浓度分别是50g/L、50g/L、0. 3g/L、9g/L、5%、20g/L ; 步骤2)骨髓多潜能干细胞悬液的制备：包括骨髓多潜能干细胞的分离提取，收集骨髓 多潜能干细胞与步骤1)制备的生理盐水混匀即制备成浓度为IX107?IX108个/ml骨髓 多潜能干细胞悬液； 步骤3)骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞悬液的制备：包括，收集步骤2)制备的骨髓多 潜能干细胞，进行骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞的诱导分化，收集骨髓多潜能干细胞源 胰岛样细胞与步骤1)制备的生理盐水混匀即制备成浓度为IX107?IX108个/ml骨髓多 潜能干细胞源胰岛样细胞悬液； 步骤4)脂肪干细胞悬液的制备：包括脂肪干细胞的分离提取，收集脂肪干细胞与步骤 1)制备的生理盐水混匀即制备成浓度为1X107?1X108个/ml脂肪干细胞悬液； 步骤5)将上述步骤2)、步骤3)和步骤4)干细胞悬液按照1:1:1进行混匀即制备成一 种治疗糖尿病的干细胞制剂。
[0013] 进一步的，所述的步骤2)中骨髓多潜能干细胞的分离提取包括以下步骤：采集健 康髂骨骨髓，以肝素抗凝。加入10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，混匀，1500r/min，离心 5min，去上清，然后用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液制成细胞悬液，进行计数板计数， 以lX106/ml的细胞数量接种于含青霉素、链霉素各1万U/100ml、含10%胎牛血清的高糖 DMEM培养液中，置于37°C，5%C02培养箱中培养，24小时后换液，以后每2天换液一次，细胞 融合达80%?90%可以传代，收集第三至五代骨髓多潜能干细胞备用。
[0014] 进一步的，所述的步骤3)中骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞的诱导分化包括以下 步骤： 第一步，将培养得到的第三至五代骨髓多潜能干细胞悬液，细胞浓度为1X106/皿接种 于transwell上层，贴壁24小时后，更换成诱导培养体系A诱导培养7天，采用10%胎牛 血清的高糖DMEM培养基，其中含有10iim〇l/ml的尼克酰胺、10ng/ml的表皮细胞生长因子 和10ng/ml的碱性成纤维生长因子，然后更换成诱导培养体系B诱导培养7天，其中含有 10ng/ml的Exendin_4、10ng/ml的0细胞调节素，10ng/mL肝细胞生长因子和10ng/mL活 化素A; 第二步，将培养得到的第三至五代骨髓多潜能干细胞悬液，细胞浓度为1X106/皿接种 于transwell下层，使其与上层诱导的胰岛样细胞共培养7天，采用10%胎牛血清的高糖 DMEM培养基，每两天换液一次； 第三步，用磷酸盐缓冲溶液洗涤后收集下层共培养后的骨髓多潜能干细胞源胰岛样细 胞。
[0015] 进一步的，所述的步骤4)中脂肪干细胞的分离提取包括以下步骤：无菌条件 下获得人体脂肪组织，剪碎后用PBS溶液清洗去除血细胞；采用消化液(含有0. 1%的 型胶原酶和2. 5%胰酶，以1:1比例混合配制而成）消化脂肪组织，反复剪碎至糊状后 170r/min震荡消化30分钟；吸取下层单个细胞的液体，移入完全培养基(含10%胎牛血清 的高糖DMEM)中终止消化，然后1500r/min离心5分钟，去上清后重悬于完全培养基中，放 入37°C，5%C02培养箱中培养。第一次换液在培养12~24小时后，观察细胞贴壁后可进行 第一次换液，此后每两天换液一次，细胞融合达80%?90%可以传代，收集第三至五代脂肪 干细胞备用。
[0016] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和积极效果： 本发明干细胞制剂所用细胞具有多向分化潜能和高增殖特性，来源丰富，取材方便，取 材容易，对机体损伤小，容易进行体外分离、培养和诱导操作，将为细胞治疗糖尿病提供丰 富的细胞来源，可在临床上大规模使用。
[0017] 本发明干细胞制剂植入体内无免疫排斥反应，弥补了目前糖尿病治疗的不足，为 临床大规模使用奠定了基础。
[0018] 本发明干细胞制剂及其制备方法使用特定的诱导培养体系，体外使骨髓多潜能干 细胞定向分化为胰岛样细胞，解决了在糖尿病持续高血糖状态下植入的细胞很难分化为可 分泌胰岛素的细胞困境。
[0019] 本发明干细胞制剂使用骨髓多潜能干细胞、骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞和脂 肪干细胞制成，联合利用骨髓多潜能干细胞、脂肪干细胞生物学优势，移植后的干细胞组 织相容性好，降低了高血糖状态容易导致移植细胞的凋亡率，可以增加移植干细胞的存活 率，对提高干细胞治疗糖尿病的疗效具有重要意义；同时胰岛样细胞和脂肪干细胞可以促 使移植的骨髓多潜能干细胞在体内向胰岛样细胞分化，并具有归巢性。
[0020] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例，配合附图详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 图1A和图1B分别为本发明中骨髓多潜能干细胞第二代培养第2天和第4天状态图， 呈长梭形； 图2为显微镜下诱导分化诱导分化的胰岛样细胞形态观察图，呈圆形或椭圆形，大小 不一，外包完整而清晰的被膜而形成细胞团； 图3为本发明中显微镜下双硫腙特异染色阳性观察图； 图4本发明中干细胞制剂移植治疗糖尿病大鼠的血糖浓度变化图。
[0022]
【具体实施方式】 下面结合附图和【具体实施方式】，进一步说明本发明。
[0023] 具体实施例1 : 一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤： 步骤1)生理盐水的制备：首先配制生理盐水，然后添加寡糖、白蛋白、胆固醇、氯化钠、 丙二醇和碳酸氢铵，使其浓度分别是50g/L、50g/L、0. 3g/L、9g/L、5%、20g/L; 步骤2)骨髓多潜能干细胞悬液的制备：包括骨髓多潜能干细胞的分离提取，收集骨髓 多潜能干细胞与步骤1)制备的生理盐水混匀即制备成浓度为IX107?IX108个/ml骨髓 多潜能干细胞悬液； 步骤3)骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞悬液的制备：包括，收集步骤2)制备的骨髓多 潜能干细胞，进行骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞的诱导分化，收集骨髓多潜能干细胞源 胰岛样细胞与步骤1)制备的生理盐水混匀即制备成浓度为IX107?IX108个/ml骨髓多 潜能干细胞源胰岛样细胞悬液； 步骤4)脂肪干细胞悬液的制备：包括脂肪干细胞的分离提取，收集脂肪干细胞与步骤 1)制备的生理盐水混匀即制备成浓度为1X107?1X108个/ml脂肪干细胞悬液； 步骤5)将上述步骤2)、步骤3)和步骤4)干细胞悬液按照1:1:1进行混匀即制备成一 种治疗糖尿病的干细胞制剂。
[0024] 进一步的，所述的步骤2)中骨髓多潜能干细胞的分离提取包括以下步骤：采集健 康髂骨骨髓，以肝素抗凝。加入10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，混匀，1500r/min，离心 5min，去上清，然后用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液制成细胞悬液，进行计数板计数， 以lX106/ml的细胞数量接种于含青霉素、链霉素各1万U/100ml、含10%胎牛血清的高糖 DMEM培养液中，置于37°C，5%C02培养箱中培养，24小时后换液，以后每2天换液一次，细胞 融合达80%?90%可以传代，收集第三至五代骨髓多潜能干细胞备用，如图1所示。
[0025] 进一步的，所述的步骤3)中骨髓多潜能干细胞源胰岛样细胞的诱导分化包括以下 步骤： 第一步，将培养得到的第三至五代骨髓多潜能干细胞悬液，细胞浓度为1X106/皿接种 于transwell上层，贴壁24小时后，更换成诱导培养体系A诱导培养7天，诱导培养体系A 采用1〇%胎牛血清的高糖〇1^培养基，其中含有1〇11111〇1/1111的尼克酰胺、1〇1^/1111的表皮 细胞生长因子和l〇ng/ml的碱性成纤维生长因子，然后更换成诱导培养体系B诱导培养7 天，其中含有l〇ng/ml的Exendin-4、10ng/ml的0细胞调节素，10ng/mL肝细胞生长因子 和10ng/mL活化素A; 第二步，将培养得到的第三至五代骨髓多潜能干细胞悬液，细胞浓度为1 X 106/皿接种 于transwell下层，使其与上层诱导的胰岛样细胞共培养7天，采用10%胎牛血清的高糖 DMEM培养基，每两天换液一次，诱导分化的胰岛样细胞如图2所示； 第三步，用磷酸盐缓冲溶液洗涤后收集下层共培养后的骨髓多潜能干细胞源胰岛样细 胞。
[0026] 进一步的，所述的步骤4)中脂肪干细胞的分离提取包括以下步骤：无菌条件下获 得人体脂肪组织，剪碎后用PBS溶液清洗去除血细胞；采用消化液(含有0. 1%的:V型胶原 酶和2. 5%胰酶，以1:1比例混合配制而成)消化脂肪组织，反复剪碎至糊状后170r/min震 荡消化30分钟；吸取下层单个细胞的液体，移入完全培养基(含10%胎牛血清的高糖DMEM) 中终止消化，然后1500r/min离心5分钟，去上清后重悬于完全培养基中，放入37°C，5% C02 培养箱中培养。第一次换液在培养12~24小时后，观察细胞贴壁后可进行第一次换液，此后 每两天换液一次，细胞融合达80%?90%可以传代，收集第三至五代脂肪干细胞备用。
[0027] 具体实施例2 :骨髓多潜能干细胞的流式检测鉴定 流式检测鉴定步骤如下：收集第三至五代骨髓多潜能干细胞，将细胞悬液移至离心管 中，1000r/min离心5min。弃去上清液，加入预冷的PBS液后，重新悬浮细胞，混勻，再次离 心。如此反复3遍。然后加入PBS液，使细胞充分混匀，制成1X106/ml的细胞悬液加入到 流式细胞检测专用试管中。依次加入⑶29、⑶34、⑶44、⑶45单克隆抗体，4°C孵育60min。 然后用PBS液漂洗3次，加入异硫氰酸荧光素（FITC)标记的二抗工作液1 : 50,4°C孵育 60min。PBS液漂洗3次。进行流式细胞仪检测，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。
[0028] 骨髓多潜能干细胞的流式细胞仪鉴定结果显示99. 55%的细胞⑶34表达为阴性、 99. 68%的细胞CD45为表达阴性，而CD29、CD44阳性表达率分别为95. 88%和97. 02%。
[0029] 具体实施例3 :双硫腙染色鉴定胰岛样细胞 将诱导的细胞用缓冲液冲洗后，加lmg/L双硫腙液，37°C孵箱孵育20min，倒置显微镜 观察细胞。将诱导后的细胞进行双硫腙染色，倒置显微镜下观察，大部分细胞团都呈亮红 色，如图3所示，表明诱导的细胞胞浆中含有锌离子，未诱导的骨髓多潜能干细胞双硫腙 染色阴性。
[0030] 具体实施例4 :脂肪干细胞的流式检测鉴定 流式检测鉴定步骤如下：收集第三至五代脂肪干细胞，将细胞悬液移至离心管中， 1000r/min离心5min。弃去上清液，加入预冷的PBS液后，重新悬浮细胞，混勻，再次离心。 如此反复3遍。然后加入PBS液，使细胞充分混匀，制成IX106/ml的细胞悬液加入到流 式细胞检测专用试管中。依次加入⑶29、⑶44、⑶90、⑶105和⑶45单克隆抗体，4°C孵育 60min。然后用PBS液漂洗3次，加入异硫氰酸荧光素（FITC)标记的二抗工作液1 : 50， 4°C孵育60min。PBS液漂洗3次。进行流式细胞仪检测，同时用PBS作为一抗设置阴性对 照。
[0031] 脂肪干细胞的流式细胞仪鉴定结果显示，阳性表达⑶29、⑶44、⑶90、⑶105阳性 表达率分别为型97. 76%、96. 64%、99. 45%、97. 63%，而造血细胞系分子标记物CD45(0. 92%) 呈阴性表达。
[0032] 具体实施例5 :大鼠糖尿病模型实验 大鼠糖尿病模型的建立：大鼠26只，雌雄不限，体重质量5-10g，分别注射链脲菌素注 射组20只，破坏胰岛细胞引发大鼠的胰岛不能再生，从而诱导大鼠患病，正常对照组6只。 用0.lmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4. 4)将链脲菌素配制成2%注射液。空腹12h 后链脲菌素注射组腹腔注射70mg/kg体重的链脲菌素，正常对照组腹腔注射70mg/kg体 重的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（PH4. 4)。小鼠分别于注射前和注射后48h、第5天和第8天 空腹断尾采血，用血糖仪测定全血血糖浓度，选取连续2次血糖浓度高于16. 7mmol/L的 小鼠作为糖尿病模型，并且可以观察到大鼠有明显多饮、多食、多尿、消瘦、皮毛污浊、活动 减少等症状，垫料潮湿，可判断大鼠糖尿病模型造模成功。
[0033] 移植治疗糖尿病的动物模型实验： 取建模成功的糖尿病大鼠随机分为两组，即干细胞制剂组和生理盐水组，用10%水合 氯醛（0. 3-0. 6ml/100g体重）腹腔注射麻醉实验大鼠，将其以俯卧位固定于消毒的木板上， 用绳子将其四肢固定，尾部备皮，用微量注射器吸入生理盐水或预先制备好的干细胞制剂 均为0.lml，经大鼠尾静脉注射。移植3、7、14、21、28天每天检测一次随机血糖水平(仪器检 测的血糖范围为〇. 6-33. 3mmol/L。当检测时血糖仪显示"Hi"，即血糖大于33. 3mmol/L，此 时计为33. 3mmol/L，以便进行统计分析)。
[0034] 应用血糖仪检测大鼠尾静脉血糖结果显示，如图4所示，生理盐水组血糖较移植 前无明显下降（P>〇. 05)，干细胞制剂组血糖移植后14天开始下降明显，与移植前相比差异 具有统计学意义（P〈〇. 01)。并可观察到干细胞制剂组大鼠多饮、多食、多尿症状改善，皮毛 干净，反应灵敏，垫料干燥。
[0035] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种治疗糖尿病的干细胞制剂，其特征在于，具体包括W下组分： a、 混匀于生理盐水的浓度为1 X IO7?1 X IO8个/ml骨髓多潜能干细胞息液1份； b、 混匀于生理盐水的浓度为1 X IO7?1 X IO8个/ml骨髓多潜能干细胞源膜岛样细胞 息液1份； C、混匀于生理盐水的浓度为1 X IO7?1 X IO8个/ml脂肪干细胞息液1份。
2. 根据权利要求1所述的一种治疗糖尿病的干细胞制剂，其特征在于，所述的生理盐 水中添加了是含有寡糖、白蛋白、胆固醇、氯化轴、丙二醇和碳酸氨馈，各成分浓度为50g/L、 50g/L、0. 3g/L、9g/L、5%、20g/L。
3. -种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括W下步骤： 步骤1)生理盐水的制备；首先配制生理盐水，然后添加寡糖、白蛋白、胆固醇、氯化轴、 丙二醇和碳酸氨馈，使其浓度分别是50g/L、50g/L、0. 3g/L、9g/L、5%、20g/L ; 步骤2)骨髓多潜能干细胞息液的制备；包括骨髓多潜能干细胞的分离提取，收集骨髓 多潜能干细胞与步骤1)制备的生理盐水混匀即制备成浓度为1 X IO7?1 X IO8个/ml骨髓 多潜能干细胞息液； 步骤3)骨髓多潜能干细胞源膜岛样细胞息液的制备；包括，收集步骤2)制备的骨髓多 潜能干细胞，进行骨髓多潜能干细胞源膜岛样细胞的诱导分化，收集骨髓多潜能干细胞源 膜岛样细胞与步骤1)制备的生理盐水混匀即制备成浓度为1 X IO7?1 X IO8个/ml骨髓多 潜能干细胞源膜岛样细胞息液； 步骤4)脂肪干细胞息液的制备；包括脂肪干细胞的分离提取，收集脂肪干细胞与步骤 1)制备的生理盐水混匀即制备成浓度为1 X IO7?1 X IO8个/ml脂肪干细胞息液； 步骤5)将上述步骤2)、步骤3)和步骤4)干细胞息液按照1:1:1进行混匀即制备成一 种治疗糖尿病的干细胞制剂。
4. 根据权利要求3所述的一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所 述的步骤2)中骨髓多潜能干细胞的分离提取包括W下步骤；采集健康骼骨骨髓，W肝素抗 凝； 加入10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，混匀，15(K)r/min，离也5min，去上清，然后用含 10%胎牛血清的高糖DMEM培养液制成细胞息液，进行计数板计数，W 1 X l〇7ml的细胞数量 接种于含青霉素、链霉素各1万U/lOOml、含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，置于37。 5%0)2培养箱中培养，24小时后换液，W后每两天换液一次，细胞融合达80%?90%可W传 代，收集第H至五代骨髓多潜能干细胞备用。
5. 根据权利要求3所述的一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所 述的步骤3)中骨髓多潜能干细胞源膜岛样细胞的诱导分化包括W下步骤： 第一步，将培养得到的第H至五代骨髓多潜能干细胞息液，细胞浓度为1 X 1〇7皿接种 于transwell上层，贴壁24小时后，更换成诱导培养体系A诱导培养7天，采用10%胎牛 血清的高糖DMEM培养基，其中含有lOymol/ml的尼克醜胺、Wng/ml的表皮细胞生长因子 和lOng/ml的碱性成纤维生长因子，然后更换成诱导培养体系B诱导培养7天，其中含有 lOng/ml的Exendin-4、10ng/ml的目细胞调节素，lOng/mL肝细胞生长因子和lOng/mL活 化素A ; 第二步，将培养得到的第H至五代骨髓多潜能干细胞息液，细胞浓度为1 X 1〇7皿接种 于transwell下层，使其与上层诱导的膜岛样细胞共培养7天，采用10%胎牛血清的高糖 DMEM培养基，每两天换液一次； 第H步，用磯酸盐缓冲溶液洗涂后收集下层共培养后的骨髓多潜能干细胞源膜岛样细 胞。
6.根据权利要求3所述的一种治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其特 征在于，所述的步骤4)中脂肪干细胞的分离提取包括W下步骤；无菌条件下获 得人体脂肪组织，剪碎后用PBS溶液清洗去除血细胞；采用消化液(含有0. 1%的 IV型胶原酶和2. 5%膜酶，W 1:1比例混合配制而成）消化脂肪组织，反复剪碎至糊状后 17化/min震荡消化30分钟；吸取下层单个细胞的液体，移入完全培养基(含10%胎牛血清 的高糖DMEM)中终止消化，然后1500r/min离也5分钟，去上清后重息于完全培养基中，放 入37 C，5% C〇2培养箱中培养； 第一次换液在培养12^24小时后，观察细胞贴壁后可进行第一次换液，此后每两天换 液一次，细胞融合达80%?90%可W传代，收集第H至五代脂肪干细胞备用。
【文档编号】A61P3/10GK104257690SQ201410545983
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】周萱 申请人:奥思达干细胞有限公司