Activin B在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了ActivinB在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用，本发明通过体内、体外实验的研究，发现ActivinB可用于治疗神经退行性疾病中，能有效减轻神经细胞凋亡，增加纹状体区TH+神经纤维密度，降低炎症反应，显著提高患有帕金森病小鼠的转棒时间、矿场运动路程和速度，且基本无毒副作用，是一种有开发前景的治疗神经退行性疾病的新药物，尤其是有望被开发为用于治疗帕金森病的新药物。
【专利说明】八8在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及八⑶&化8在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]帕金森病是第二大常见的神经系统退行性病变，其主要症状是运动功能的改变，如运动过缓、静止震颤、步态畸形和姿势不稳等病变，最后导致运动能力丧失。黑质纹状体多巴胺神经元死亡是帕金森主要的病理特征。
[0003]帕金森病的病因和发病机制十分复杂，至今仍未彻底明确，目前临床上帕金森病的治疗方案，包括药物治疗、细胞替代治疗和手术治疗等都未能达到理想的治疗效果。因此，寻找能够有效预防或改善帕金森症状的药物是目前最紧要的目标。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供八8在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
[0005]本发明所采取的技术方案是:
本发明通过体内、体外实验的研究，发现八8对神经退行性疾病具有治疗作用，尤其是对帕金森这一类神经退行性疾病具有很好的治疗效果，并且八8对细胞基本无毒副作用，具有很好的开发前景，有望被开发为用于治疗神经退行性疾病的新药物。
[0006]本发明的有益效果是:
本发明将八8用于治疗神经退行性疾病的药物中的应用中，证明了八8可减轻神经细胞凋亡，增加纹状体区神经纤维密度，降低炎症反应，显著提高患有帕金森病小鼠的转棒时间、矿场运动路程和速度，且基本无毒副作用，是一种有开发前景的治疗神经退行性疾病的药物，尤其是有望被开发为用于治疗帕金森病的新药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为III法检测八巧&化8对即?+诱导细胞凋亡的影响；％11116:用生理盐水处理的对照组，1？？^:经腿处理后用正常培养基培养，80^5118/1111:经即?+处理后用含51^/1111八。七1乂111 8的培养基培养，狀1:10118/1111:经1？？丨处理后用含101^/1111八。七1乂111 8的培养基培养，80^25118/1111:经肥?+处理后用含25叩加1 ^0^^111 8的培养基培养；
图2为!10601181:核染法检测八01:1^111 8对1？？丨诱导细胞凋亡的影响:用生理盐水处理的对照组，肥?+:经肥?+处理后用正常培养基培养，III卯:经肥?+处理后用含 10118/1111 ^01:1^111 8 的培养基培养，III卯+3(31:25118/1111:经 1？？丨处理后用含 251^/1111^0^^111 8的培养基培养；
图3为免疫组织化学染色法检测八8对1？1？诱导脑组织损伤的影响； 图4为不同处理组小鼠在转棒实验中的转棒时间；
图5为不同处理组小鼠在旷场实验中的平均运动速度和运动总路程。
【具体实施方式】
[0008]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0009]八⑶?丨]!是转化生长因子超家族的一员，包括801:1^1118及八8三种亚型，80^1^1！！参与体内的激素水平调节、胚胎发育、抗炎以及器官与组织的损伤与修复。
[0010]实施例1
一、体外实验
1.1实验细胞:311-3151细胞，培养于含1%青链霉素和10%胎牛血清的高糖0腿1培养基。即?8溶于生理盐水备用。
[0011]1.2实验方法及分组:将311-3151细胞血清饥饿24小时，用含25 0111/1111即?+的培养基孵育细胞12匕换至正常培养基培养2处后，随机分成4组(第①组为模型组，腿处理后，用正常培养基继续培养2处8 5118/1111…--"处理后用含511^/1111 8的培养基培养2处8 25叩加1:肥?+处理后用含251^/1111 八。七1乂111 8 的培养基培养 2411，④ I？？、八。1:1乂111 8 50118/1111:1？？丨处理后用含 50118/1111^0^^111 8的培养基培养2411 ；另取第⑤组％11116对照组，取血清饥饿24小时的311-3151细胞用含％11116的培养基进行培养。各组间的细胞用量、培养液体积、培养时间和温度等其他条件均一致。
[0012]1.3 III法检测细胞活性
将浓度为105个细胞接种50^ [于96孔板中，按照1.2中的实验方法及分组进行实验。检测前每孔加入50 ^ I III，细胞送回培养箱孵育2卜，每孔加100 ^ I 0180溶解，30-11后紫外分光光度计读数。
[0013]检测结果如图1所示，从中可以看出腿可诱导311-3151细胞发生凋亡，在加入1011^/1111^2511^/1111 ^01:1^111 8后，八⑶?丨]! 8对1？？丨处理的別-3151细胞发挥了神经保护作用，减少了细胞的凋亡。
[0014]1.4 006(^0核染检测细胞凋亡情况
细胞接种于24孔板中，按照以上细胞实验方法及分组进行实验。！！06也0染核液与细胞共孵育15-！！，即拿去倒置荧光显微镜下拍照。观察核碎裂核固缩情况。
[0015]检测结果如图2所述，从中可以看出即?+可诱导311-3151细胞发生核碎裂核固缩(如图2中的箭头所示),在加入1011^/1111^25118/1111八。七1乂111 8后，八。七1乂111 8对处理的別-巧51细胞发挥了神经保护作用，减少了细胞的核碎裂核固缩。
[0016]综上所述，体外实验117检测与此一也#荧光染色结果显示1卯+可显著诱导细胞凋亡，八⑶?化8可以明显减轻肥?+导致的311-3151细胞凋亡，并且呈现出剂量依赖性。可见，八⑶?化8可有效抑制311-3151细胞凋亡。
[0017]二、体内实验
2.1实验动物:8-10周龄雄性057小鼠(体重20-250。所有小鼠自由饮水饮食，并维持在1211:1211光:暗的恒温恒湿环境中。
[0018]2.2帕金森病小鼠模型的制备:1？1？ 20呢八8，连续腹腔注射5天，制作帕金森病小鼠模型，参照文献(^.^80^8011-16^18 811(1 8.^1^26(11301-8^1.？1~01:0⑶ 1 1:116 1？丁？11101186 1110(161 0？卩81^1118011’ 8 (1186886 [^].?&七卩1~01:00， 2007， 2(1): 141—51.) 2.3动物分组及药物处理:①3^111116+82111116组:连续腹腔注射3311116 (生理盐水)5天，注射剂量和腿相同，小鼠脑纹状体尾壳核区(0?)立体定位注射8311116，每侧2^1。
[0019]②即吓+%111^组:连续腹腔注射即I？ 5天，一天一次，注射量为20呢八8，然后对小鼠脑纹状体尾壳核区(0?)立体定位注射无菌生理盐水，每侧2 0 1，一天一次，共注射5天。
[0020]③1？了？十狀1:1^111 8组:连续腹腔注射1？了？ 5天，一天一次，注射量为20呢八8，然后对小鼠脑纹状体尾壳核区(0?)立体定位注射八⑶&化8，每侧注射2^1 25118/0 [的^01:1^111 8，一天一次，共注射5天。
[0021]2.4免疫组织化学染色
按上述2.3的动物分组及药物处理，在小鼠立体定位注射7、21、35天后，用4%多聚甲醛灌注固定后，取脑放置于4%多聚甲醛中固定过夜，转移到20%蔗糖中脱水过夜，再转移至30%蔗糖脱水过夜，冰冻切片机切片，厚度25 ^ %放置于细胞保护液中。采用捞片法进行免疫组织化学染色。
[0022]染色结果如图3所示，从中可以看出即I？可引起黑质多巴胺能神经元细胞数量减少(如图3八和图38所示)，同时，即I？还可以引起纹状体区1?阳性神经元数减少，而给予^0^^1118进行预处理后第7天，八⑶&化8对1?阳性神经元有神经保护作用，降低腿对1?阳性神经元的损伤(图3(:和图^[(所示)。在21天后八巧&化8组与即I？的效果没有明显差异，由于八8较1？1？的作用时间短，其药效时间有限，而1？1？的药效时间较长，因此若想取得好的治疗效果，需要间断连续地给予八8进行治疗(图3(:和图30所示
[0023]2.5转棒实验
转棒实验采用小鼠转棒仪完成，按照上述2.3的动物分组及药物处理，在小鼠立体定位注射7、21、35天后，将各组小鼠站立于传帮仪滚轴处308以适应环境。转棒仪设定参数终速度40转/111111,加速度308，总记录时间为3008，期间记录不同轨道小鼠跌落的时间。
[0024]实验结果如图4所示，从中可以看出在即I？处理后的第七天起，即I？可导致小鼠转棒时间减少，而给予八8进行治疗后第7天，八01:1^1118可明显增长小鼠的转棒时间，减轻1？1？诱异模拟的帕金森病症；在21天后各组之间没有明显的差异。
[0025]2.6旷场实验
按照上述2.3的动物分组及药物处理，在小鼠立体定位注射7、21、35天后，将各组小鼠放置于行为学检测室中一小时适应环境，提取小鼠尾部放置于矿场中间部位，小鼠于矿场中自由活动501！！，摄像头记录采集小鼠活动，采取五分钟内平均运动速度和运动总路程作为参考指标。
[0026]实验结果如图5所示，从图5八中可以看出在即I？处理第七天后，1？1？可导致小鼠平均运动速度减慢，而给予八进行治疗后第7天，八⑶&丨沛可明显增加小鼠平均运动速度。从图58中可以看出在即I？处理第七天后，1？1？可导致小鼠运动总路程减少，而给予八(^&丨沛进行治疗后第7天，八(^&丨沛可明显增加小鼠运动总路程。在21天后各组之间没有明显的差异。
[0027]上述体内实验结果显示,小鼠脑部双侧0?区立体定位注射25=8八11的八
2111，在第7天，与肥I？组相比，八(^丨対汕注射组0?区丁矿神经纤维密度明显增高(1) ?0.05),转棒时间、矿场运动路程和速度显著增高(1) ?8在1？丁？诱导的帕金森病小鼠模型中增加纹状体区1矿神经纤维密度，对神经元起保护作用。
[0028]综上所述，八⑶&化8可减轻神经元细胞凋亡，增加纹状体区1矿神经纤维密度，降低炎症反应，显著提高转棒时间、矿场运动路程和速度，且基本无毒副作用，是一种有开发前景的治疗神经退行性疾病的药物，尤其是治疗帕金森病的药物。八⑶?化8是转化生长因子超家族的一员，通过降低细胞凋亡，增加纹状体区神经纤维密度，降低炎症反应，从而减轻帕金森病多巴胺能神经元损伤，改善帕金森病模型小鼠行为学变化，在神经元细胞损伤中具有保护作用。
【权利要求】
1.Activin B在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述神经退行性疾病为帕金森病。
3.一种制备治疗神经退行性疾病的药剂，其特征在于:其活性成分为Activin B。
4.根据权利要求3所述一种制备治疗神经退行性疾病的药剂，其特征在于:含有活性成分Activin B和药物上可接受的载体和/或稀释剂。
5.根据权利要求3?4任一所述一种制备治疗神经退行性疾病的药剂，其特征在于:所述神经退行性疾病为帕金森病。
【文档编号】A61P25/16GK104353060SQ201410545766
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】张璐, 张琳, 李娟 , 薛进华 申请人:南方医科大学