用于神经退行性病症的生物化学标志物的制作方法
【专利摘要】用于对与神经退行性病症相关的肽片段进行定量的生物测定方法，所述肽片段包含由分泌酶(例如ADAM10)切割Tau蛋白所形成的新表位，所述方法包括将来源于血液的样品与对所述新表位有特异性的抗体相接触，以及测定所述免疫结合伴侣与所述样品中的肽片段的结合水平。发现含新表位的肽的水平与认知功能负相关。
【专利说明】用于神经退行性病症的生物化学标志物
[0001]本发明涉及神经退行性病症或神经退行的生物标志物的开发，更具体地涉及用于检测生物化学标志物的测定，所述生物化学标志物在阿尔茨海默氏病的诊断应用中和疾病发展的预后中有价值，其包括指示对治疗方案的应答的生物化学标志物。[0002]阿尔茨海默氏病(AD，通常被称为阿尔茨海默(Alzheimer’s))是进行性且最终致命的神经性病症，其主要影响65岁以上的人群。据估算在世界范围内AD已影响3.56亿的人口(2009)，且预测这个数字会每20年翻倍。仅在美国，每年AD的花费就合计超过1480亿美元，且在世界范围内这个数字超过3200亿美元[3]，经比较，与痴呆症(其中AD占病例的50-75% )看护相关的花费显然超出了与癌症和心脏病看护相关的花费，这突显出对于个人以及卫生保健二者AD都是严峻的社会负担。虽然阿尔茨海默氏病的病程存在个体差异，但有一些共同症状，这些症状中最早的通常是认知性的，其往往被错误地认为是由年龄增长或压力造成的[37]。早期症状包括短期记忆衰退，如果怀疑患病，进行行为评估和认知测试以及如果可行的话进行脑部MR扫描以进一步确认诊断[37]。随着疾病进展，包括一系列神经性问题的症状(例如思维混乱、易怒和有攻击性、语言障碍、长期记忆缺失)导致个体变得性格内向[2]。最终，身体功能开始衰退，最终导致死亡，并且确诊后的平均预期寿命约为七年[2 ;28]。
[0003]与更好地治疗和了解AD相关的主要问题是，该疾病的早期发生隐蔽，因此AD通常经过若干年发展后才充分表现出来并导致确诊[13]。此外，在大多数病例中，通常只有在其它造成AD症状的可能原因都被排除的情况下具有AD症状的个体才被诊断为该疾病的“可能”患者。虽然诊断标准已通过使用智力功能测试而标准化，但普遍接受的仍然是AD仅可通过尸检来最终确诊[27]。
[0004]近期的研究表明使用生物化学标志物以及成像技术取得了一些进展，但这些方法仍需进一步鉴定和确认，且通常因在发病早期阶段缺乏敏感度而受局限[24 ；33 ；34 ；38 ；39]。
[0005]目前使用的治疗提供了小的姑息性作用；并且能够减缓或抑制进展的治疗是被热切追寻的目标，这通过以下事实说明:已进行超过500个临床试验来鉴定AD的可行疗法，但目前仍没有能明确鉴定到可行疗法[I]。这些数据以及已建立的AD生物标志物的缺乏性都清楚地说明投入开发这样的生物标志物的必要性，即可以更准确地反映AD的重要方面(例如疾病的发作、进展及对治疗的应答)的生物标志物。
[0006]除涉及APOE ε 4变体的病例外，评估阿尔茨海默氏病的风险几乎是不可能的[8]。此外，虽然可以监测试验药物的疗效，但这种监测通常直接与药物的作用方式而非AD的整体病理学相关[8]。
[0007]来自AD个体的脑组织的分析突出了细胞外基质重塑的紊乱[12]，主要显示了两个重要的现象，即含有β淀粉样蛋白(Αβ)的斑块的形成，和含有Tau蛋白的经修饰形式的神经元纤维缠结的形成[10]。这两种过程都与疾病的进展高度相关，并且有趣的是，Αβ在斑块的沉积要先于实际的神经元损伤[30]，但参与触发神经元纤维缠结的形成[32]，后者似乎是神经元细胞死亡的主要原因[5;18]。APP是在许多组织中表达并且集中在神经元突触的整合膜蛋白。APP的主要功能未知，最经常将其作为β淀粉样蛋白(Αβ，39至42个氨基酸的肽)的前体分子来研究，当以淀粉样蛋白纤维形式存在时，其是淀粉样蛋白斑块的主要组分[10]。Αβ由两种蛋白水解切割产生，第一种切割通过β-分泌酶(BACE-1)进行并且第二种切割通过Y-分泌酶进行。这些连续的生物化学事件对Αβ的形成至关重要[10]。此外，APP的其它酶促切割(例如通过ADAMlO (解整合素和金属蛋白酶10，ADisintegrin And MetalloproteinaselO)和早老素-1的酶促切割)以及其它类型的翻译后修饰产生了临床意义仍未完全阐明(尽管预计他们与疾病进展相关)的经修饰肽片段[10 ；11 ；19 ；25 ；40]。
[0008]Tau蛋白是微管稳定蛋白，其在中枢神经系统的神经元内高度富集，而在CNS之外是罕见的，在AD中Tau是神经元纤维缠结形成的重要组分[10]。此外，Tau突变与一系列神经退行性疾病(被称为Tau病变(Tauopathies))相关；而迄今AD是与Tau蛋白改变相关的最常见疾病[10 ;17]。已证实翻译后修饰(例如磷酸化以及酶促切割)调节Tau稳定微管的能力从而使得形成神经元纤维缠结以及潜在地形成毒性小蛋白积累，这可以造成神经兀死亡以及由此引起的疾病进展[10 ; 19]。编码tau蛋白的MAPT (微管相关蛋白Tau)基因位于染色体17q21处，其包含16个外显子。人脑中的主要tau蛋白由11个外显子编码。第2、3和10个外显子通过选择性剪接产生六种组合(2_3_10_ ;2+3_10_ ;2+3+10_ ;2_3_10+ ；2+3_10+ ；2+3+10+)。因此，在人脑中，tau蛋白形成具有352到441个氨基酸的六种同种型的家族。它们的区别为在N端部分有O个、I个或2个29个氨基酸的插入(第2和3个外显子)，以及在C端部分外显子10缺失造成的3个或者4个重复区域。所以，在CNS中最长的同种型具有4个重复(Rl、R2、R3和R4)以及两个插入(共441个氨基酸)，而最短的同种型具有3个重复(R1、R3和R4)且没有插入(共352个氨基酸)[20]。MAPT基因具有Hl和H2这两种单倍群(haplogroup)，其中基因以反向出现。单倍群H2仅在欧洲或者欧洲人为祖先的人群中常见。单倍群Hl似乎与某些痴呆症(例如阿尔茨海默氏病)的可能性提高相关。所有这些同种型都被发现于神经元中；然而不同的同种型在阿尔茨海默氏病病理学中起作用的程度仍不清楚[20]。
[0009]与Tau加工相关的酶包括胱天蛋白酶、凝血酶，以及其它与神经元组织转化高度相关的蛋白酶，例如MMP[4 ；10 ；10 ；14 ；15 ；19 ；26 ；29 ;31]。而本发明则涉及另一种酶类型，即分泌酶。
[0010]分泌酶以α、β和Y分泌酶这三种类型存在[10]。被称作分泌酶的酶在传统上与蛋白质的细胞外切割相关，在阿尔茨海默的情况下分泌酶主要与淀粉样前体蛋白(APP)的切割相关，该切割导致生成淀粉样蛋白β，其是形成淀粉样斑块的主要决定因素[10]。这些分类是依据其切割APP的蛋白质中的位点来定义的，而对于病理学相关性，已知这三类分泌酶中任何一类的功能紊乱均导致阿尔茨海默样的病理[10 ；11 ；35 ;36]。
[0011]酶的列表包括:
[0012]α -分泌酶包括:ADAM9、10、17 (TACE)、19 和 BACE2，
[0013]β -分泌酶包括:BACE1和2
[0014]Y-分泌酶复合物:早老素I和/或2、呆蛋白(Nicastrin)、Aph-la、Aphlb和Pen-2ο
[0015]由于将他们的功能描述为分泌酶，所以从未评估这些酶降解Tau的能力。而公知Tau在阿尔茨海默氏病的进展中被大程度加工[14 ;15 ;17 ;26 ;29]。已知切割Tau并由此被认为参与诱导神经元死亡的酶包括胱天蛋白酶家族和钙蛋白酶，用这些酶处理Tau导致产生一系列被良好描述的片段，推测所述片段导致神经元细胞死亡[10 ;32]。
[0016]我们目前探索了由分泌酶介导的Tau切割导致产生可被用作阿尔茨海默氏病之生物化学标志物的片段的可行性。
[0017]在第一方面，本发明现在提供了用于对肽片段进行定量的生物测定方法，所述肽片段包含由分泌酶切割蛋白质所形成的新表位，所述方法包括将包含所述肽片段的样品与对所述新表位有特异结合能力的免疫结合伴侣(immunological binding partner)相接触，以及测定所述免疫结合伴侣与所述样品中的肽片段的结合水平，其中所述蛋白质是Tau蛋白。
[0018]Tau蛋白可来源于任何哺乳动物,包括哨齿动物,例如小鼠或大鼠，也包括狗或者猴，但优选来源于人。
[0019]所述新表位优选不是由胱天蛋白酶家族和/或钙蛋白酶切割Tau所形成的新表位。
[0020]任选地，所述免疫结合伴侣对包含Tau蛋白C端新表位的肽片段具有特异结合亲和力。或者，所述免疫结合伴侣对包含Tau蛋白N端新表位的肽片段具有特异结合亲和力。
[0021]所述蛋白质可以是Tau-A或Tau家族的任何其它成员。所述新表位可以是两个或更多个或全部Tau蛋白共有的。
[0022]新表位可优选地由ADAMlO或BASE-1切割Tau蛋白而形成。其可以经多于一种分泌酶形成。
[0023]所述免疫结合伴侣优选对包含由蛋白酶切割Tau蛋白所形成之新表位的肽片段具有特异结合亲和力，所述切割产生以下人Tau部分序列中的任意一种(表1):`[0024]
【权利要求】
1.用于对肽片段进行定量的生物测定方法，所述肽片段包含由分泌酶切割蛋白质而形成的新表位，所述方法包括使包含所述肽片段的样品与对所述新表位有特异性结合亲和力的免疫结合伴侣相接触，以及检测所述免疫结合伴侣对所述样品中肽片段的结合水平，其中所述蛋白质是Tau蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述免疫结合伴侣对包含Tau蛋白C端新表位的肽片段有特异性结合亲和力。
3.权利要求1的方法，其中所述免疫结合伴侣对包含Tau蛋白N端新表位的肽片段有特异性结合亲和力。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白质是Tau-A。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述新表位由ADAMlO或BASE-1切割Tau蛋白而形成。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述免疫结合伴侣对包含新表位的肽片段有特异性结合亲和力，所述新表位由蛋白酶切割Tau蛋白以产生任一种以下Tau部分序列而形成:
7.权利要求6的方法，其中所述免疫结合伴侣对肽N端的任意以下序列有特异性结合亲和力:
8.权利要求6的方法，其中所述免疫结合伴侣对肽N端的以下序列有特异性结合亲和力:TPRGAAPPGQ(SEQ ID N0246)。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述免疫结合伴侣是有特异性结合亲和力的单克隆抗体片段或者单克隆抗体。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法以竞争免疫测定的方式进行，在所述竞争免疫测定中在所述样品的存在下孵育所述免疫结合伴侣和竞争剂，并且所述竞争剂与所述样品中的肽片段竞争结合所述免疫结合伴侣。
11.权利要求10的方法，其中所述竞争剂是合成的肽，或者是通过切割所述表位所来源的蛋白质以显露所述新表位而形成的经纯化天然肽。
12.权利要求11的方法，其中所述竞争剂包含肽，所述肽包含N端序列TPRGAAPPGQ(SEQID N0246)。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品是尿液、血清、血液、血浆或唾液样品O
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品是来源于患者的样品，所述方法还包括将所测定的所述肽片段的所述结合水平与数值相比较，所述数值是a)可比较的健康个体和/或(b)病理性神经退行性病症的特征性数值。
15.免疫结合伴侣，其针对由分泌酶切割Tau蛋白所形成的C端或N端新表位。
16.权利要求15的免疫结合伴侣，其与任一种以下氨基酸序列的N端有特异性免疫反应性:
17.权利要求15或权利要求16的免疫结合伴侣，其为单克隆抗体或其结合片段。
18.细胞系，其产生权利要求17所述的单克隆抗体。
19.肽，其包含由分泌酶切割Tau蛋白而形成的C端或N端新表位，所述切割在任一种权利要求6所示的所述Tau蛋白部分序列的末端处进行。
20.权利要求19的肽，其作为半抗原缀合至载体以用于产生对所述肽的免疫应答，或者固定至固体表面或缀合至可检测标记以用于免疫测定。
21.编码肽的分离的核酸分子，所述肽包含由分泌酶切割所述Tau蛋白而形成的C端或N端新表位，所述切割在任一种权利要求6所示的所述Tau蛋白部分序列处进行。
22.包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含表达信号和编码肽的表达的编码序列，所述肽包含由分泌酶切割所述Tau蛋白而形成的C端或N端新表位，所述切割在任一种权利要求6所示的所述蛋白部分序列中进行。
23.宿主细胞，其用权利要求22所述的载体转化并表达所述肽。
24.免疫测定试剂盒，其包含权利要求15至17中任一项所述的免疫结合伴侣和结合所述免疫结合伴侣的竞争剂，以及任选的以下一种或更多种:清洗试剂、缓冲剂、中止试剂、酶标记、酶标记底物、校正标准品、抗小鼠抗体和使用所述试剂盒进行测定的说明书。
【文档编号】C12N5/00GK103827311SQ201280033143
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年7月4日 优先权日:2011年7月4日
【发明者】娜塔莎·巴拉斯丘克, 莫滕·卡尔斯达尔, 基姆·亨里克森 申请人:北欧生物科技公司