干细胞的制作方法

专利名称：干细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及干细胞，具体涉及可从骨髓和血液中分离的新型干细胞。
干细胞可产生新细胞以修复身体中任何组织的损害，并因此对于所有类型的再生医学具有极大的潜能。干细胞存在于所有身体组织和器官中，但是一些组织和器官，像骨髓和血液，要比其它组织和器官，像肝脏和脑更容易获得。然而，干细胞在骨髓和血液中存在的数目非常小，且在它们可在临床上使用前必需先提取出来然后再增加数目(“扩大”)。当前，正进行许多尝试以达到提供足够数目的干细胞以用于进行组织特异性干细胞移植的目的。
各种努力集中在骨髓作为干细胞的来源。到此为止的证据提示骨髓含有两类干细胞-负责产生血液的造血干细胞(HSC)，以及能产生属于有限范围的躯体组织细胞的间充质干细胞(MSC)。MSC不能被精确地定义或分离并且显示有限的提供多种细胞类型的能力。它们对培养物中的刺激作出反应，形成成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞，但是有许多细胞类型它们不能形成，如肝细胞。MSC的延长培养导致长出称作多潜能成年祖细胞(MAPC)的细胞亚群，其到目前为止似乎具有最广泛的组织再生的潜能。然而，在MAPC出现前，需要延长组织培养时间以及许多细胞分裂的事实意味着，首先，它们可能已经累积了遗传损害，且其次，不可能肯定它们一定代表骨髓的正常细胞成分。事实上，它们可能是组织培养的人工产物。这些重要的考虑潜在地表明MAPC不能用于临床。MAPC可形成具有内胚层、外胚层或中胚层标记的细胞，但是很重要地是，在培养物中不产生造血细胞。
使用从干细胞衍生的分化细胞生产它们的天然蛋白产物优于使用细胞产生重组蛋白，特别是由于能进行蛋白产物的适当的糖基化和翻译后的修饰。
本发明人现在已经鉴定了一种新型干细胞，其可直接从成人骨髓和血液中分离，例如，外周血，并且具有分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞的独特能力。如果不是全潜能的话，这些细胞因此很显然是多潜能的。因此这里所描述的干细胞提供用于可以以自体(自己对自己)方式进行组织移植的新的细胞来源。此外，如下所述，这些干细胞不需要延长的组织培养。
本发明的干细胞优选地从成人获取的样品中获得，如成人骨髓或成人外周血。因此细胞优选地是成人干细胞。细胞也可从其它样品如脐带中获得，且因此在一个实施方案中，本发明的干细胞群体可包括胎儿以及成人细胞。也可使用胎儿来源，例如胎肝或骨髓。
因此，在本发明的一个方面，提供分离的干细胞群体，其中所述干细胞是CD34+，能够自我再生并且能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞，优选地分化成造血细胞。优选地，干细胞是成人干细胞。
这些干细胞的另一个特征是在培养期间，它们能粘附到塑料(例如，标准组织培养容器的塑料)上。因此在这里所描述的培养方法中细胞“能”粘附到塑料上，并且不需要任何特殊的另外的条件或修饰。适当的容器是由Corning Incorporated，New York，美国生产的那些容器。
本发明干细胞的另外特征是它们不需要饲养层，即支持干细胞生长的细胞(一般通过γ照射灭活，其供给重要的代谢物，而它们自己不进一步生长或分裂)。因此，优选地，在干细胞的培养期间不使用饲养层。
这些干细胞的一个主要特征和特别有利的特色是它们能分化成非常广泛的各种不同的细胞类型，包括外胚层、中胚层和内胚层细胞。因此，本发明的这些干细胞可分化成由胚胎的三种胚层，外胚层、中胚层和内胚层发育衍生的细胞类型；例如来自中胚层的造血细胞和肌细胞；来自外胚层的神经细胞或上皮细胞；以及来自内胚层的腺上皮或肝细胞。
由于基本上无其它的细胞类型，所以细胞群体是“分离的”。优选地，基本上无表达CD33、CD38、HLA/DR、CD19和CD3的细胞类型。“基本上无”应当被解释为与实施例中所提供的经验数据一致。同样地，群体基本上无专门用于特定谱系的细胞和/或携带与此有关标记的细胞。优选地群体具有低于20％，更优选地低于10％，例如，低于5％的谱系定向细胞。其可能在本发明干细胞群体的分离中有助于结合阴性选择(细胞的除去)和阳性选择(细胞的分离)，在两种情况中都可能使用抗体结合。“分离的”细胞包括直接从样品中分离的那些细胞以及从这种样品中培养的或衍生的细胞。
认为干细胞是在成人骨髓中产生的，但是在血液中也发现了干细胞。可根据标准采样技术从这些来源的任一种中收集本发明的干细胞。优选地在用G-CSF进行干细胞动员以增加干细胞在循环中的数目后获取血液样品。例如，可皮下施用5μg/kg体重/天，持续5天。也可能直接获取骨髓样品，例如，通过吸引术。
可从骨髓的来源中获取骨髓细胞，例如，髂嵴、胫骨、股骨、脊柱或者其它骨腔。可根据常规技术方便地从骨中吸出骨髓。干细胞的其它来源包括血液，包括成人外周血和脐带血。
细胞优选地是哺乳动物来源的，即，从哺乳动物样品中分离的或者从这种样品中所分离的细胞中衍生的。特别优选的哺乳动物是人和小鼠。更优选的哺乳动物包括母牛、马和伴侣动物。
可使用各种技术通过初步取出专用谱系的细胞以分离细胞。单克隆抗体对鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标记(表面膜蛋白)特别有用。可将抗体附着到固体支持物上以允许粗分离。所使用的分离技术应当将要收集的级分的生存力的保持最大化。“相对粗的”分离，即，其中存在的最高10％，通常不超过约5％，优选地不超过约1％的总细胞不具有标记，但可与将要保留的细胞群体一起保留，可使用不同效率的各种技术。所使用的特定技术将取决于分离的效率、方法的细胞毒性、进行的容易程度和速度、以及对复杂装置和/或技术技能的必要性。
分离的方法可包括磁性分离，其中使用抗体包被的磁珠；亲和层析；与单克隆抗体结合的或与单克隆抗体结合使用的细胞毒性剂，例如，补体和细胞毒素；以及用附着到固体基质，例如，平板上的抗体的“淘选(panning)”；或者其它适当的技术。提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选仪，其可具有各种复杂程度，例如，多个色道、低角度和钝光散射检测通道、阻抗通道等。
方便地，可将抗体与标记缀合，所述标记如磁珠，其允许直接分离；生物素，其可用与支持物结合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白除去；荧光染料，其可与荧光激活细胞分选仪一起使用，等等，以允许很容易地分离特定的细胞类型。可使用不过度地伤害剩余细胞生存力的任何技术。
优选地使用LymphoprepTM(Axis Shield)密度梯度分离血液或骨髓样品的单核级分。可使用MiniMACS(Miltenyi Biotec)技术从单核级分中分离CD34+细胞。
本发明的干细胞可进一步通过获得它们所用的方法来表征，因此细胞可通过组合的亲和纯化和通过粘附的选择方法获得。更具体地，细胞可用CD34单克隆抗体(MAb)标记，然后用本身结合CD34 MAb的(顺)磁珠标记。可选择地，可使用结合细胞的，本身用CD34 MAb标记的珠。然后可将标记的或结合的细胞应用到柱上，并通过磁体保持在适当的位置上；未被标记的细胞将被洗脱下来，且通过除去磁体(或者通过从磁体移去柱)释放被标记的细胞。
然后可将如此释放的CD34+细胞在适当的温度下，例如在35-38℃之间，优选地在37℃在组织培养塑料容器中温育至少2小时，优选地至少3小时，例如，3-5小时，其中通过用HBSS(Hanks氏平衡盐溶液)洗涤除去非粘附的细胞。粘附的CD34+细胞是本发明的干细胞，且包含低于1％的总CD34+群体。它们优选地是基本上同质的群体，通常不被其它干细胞亚群污染。一般地，低于30％，优选地低于20％，更优选地低于5％，最优选地低于3％的所收集细胞与本发明的干细胞不同。然而，实施例显示不可能在分离的群体中的每个细胞上都发现所有单独的标记，且术语“同质群体”应当用这个观点来解释。本发明的干细胞群体优选地在CD34表达、粘附到组织培养级塑料和小淋巴细胞样形态学方面同质。“粘附的”细胞被定义为能抵抗三次剧烈的洗涤而不从固体支持物(特别是组织培养级塑料或玻璃)脱附的那些细胞。由于当制备用于培养的细胞时通常抛弃粘附细胞，所以CD34+细胞的粘附亚型的有利的性质令人惊讶。
本发明的干细胞能自我再生，即，根据干细胞的标准定义，干细胞能分裂形成另外的干细胞，以及分化成各种不同的细胞类型。
本发明的干细胞进一步被表征为CD34+，即，在干细胞，特别是在骨髓中所生产的干细胞(HSC和MSC)上表达抗原CD34，即一种所发现的糖蛋白标记，但不是仅仅如此。也可富集表达Thy-1标记的细胞的本发明的干细胞群体，即，包括非常大比例的Thy-1+细胞。因此可富集相对于起始细胞群体(样品)的Thy-1的干细胞群体。实施例5表明平均28.1％，但是最高90％的细胞都是Thy-1+。
更具体地，细胞可被表征为CD34+、CD38-、CD33-和HLA-DR-。优选地细胞群体也富有AC133+、Thy-1+和/或c-met+，更优选地细胞主要地是AC133+、Thy-1+和/或c-met+。
干细胞是淋巴细胞样的，因为它们是圆的单核的细胞并且相当小，具有高的核胞质比。这种形态学与原始干细胞有关。
它们的特征是能在培养中在少于16天，例如12-14天产生分化的细胞。优选地在少于14天，例如，少于10天，更优选地在少于7天，甚至在4-5天便可观察到分化。
可进一步表征根据下列步骤获得的本发明的干细胞(i)将造血组织(即，血液或骨髓样品)进行密度梯度分离；(ii)使低密度细胞接触CD34的亲和配体(优选地附着到顺磁珠上)(iii)回收附着到所述CD34配体上的细胞；(iv)使CD34+亚群接触组织培养级塑料；和(v)回收粘附到塑料上的CD34+细胞。
将本发明的干细胞样品于2004年9月24日保藏到欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，Health Protection Agency，Porton Down，Salisbury，SP40JG，英国，登记号为04092401。保藏由本发明人作出并且将细胞系命名为“干细胞Omnicyte”。
本发明的干细胞可来自任何动物，例如，实验室、家畜或伴侣的动物；优选地来自灵长类动物，最优选地来自人。
在另一个实施方案中，本发明提供一种培养物，包括(i)一种分离的成人干细胞群体，其中所述的干细胞是CD34+，能自我再生并且能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞；和(ii)能支持所述干细胞生长的培养基。
优选地，本发明提供一种培养物，包括(i)一种(分离的)干细胞群体，其中所述的干细胞是CD34+，能自我再生并且能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞以及能粘附到组织培养级塑料上；和(ii)能支持所述干细胞生长的培养基。
一旦干细胞被分离，它们就可通过下述方法繁殖，在基质细胞的条件培养基中生长，如可从骨髓、胎儿胸腺或胎肝中获得且显示能提供分泌与干细胞维持有关的生长因子的基质细胞，与这种基质细胞共培养，或者在包含支持干细胞增殖的维持因子的培养基中生长，其中基质细胞可以是自体的、同种异体的或异种的。在用于共培养前，混合的基质细胞制剂可以是无造血细胞的，其中使用适当单克隆抗体除去不期望的细胞，例如，用抗体-毒素缀合物，抗体和补体等。可选择地，可使用克隆的基质细胞系，其中基质细胞系可以是同种异体的或异种的。因此，上面所指的“培养基”包括如基质细胞这样的细胞。
本发明的干细胞和从其衍生的分化的细胞可在液氮中的深低温保藏下存活。
在另一个方面，本发明提供一种分离成人干细胞群体的方法，其中所述的干细胞是CD34+，能自我再生并且能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞，其中该方法包括从受试者中采集血液或骨髓样品和从其中提取所述的细胞群体。优选地，本发明提供一种分离干细胞群体的方法，其中所述的干细胞是CD34+，能自我再生并能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞以及能粘附到组织培养级塑料上，其中该方法包括从受试者中采集血液或骨髓样品以及从中提取所述的细胞群体。上面讨论了优选的提取步骤，且在血液取样的情况中，一般地干细胞动员将是第一步，其优选地通过向受试者施用G-CSF来完成。
粘附到组织培养塑料上是包括骨髓间充质干细胞、单核细胞和巨噬细胞的几种细胞类型的特征，但是以前一直没有用于表征或分离CD34阳性细胞亚群。已发现粘附到组织培养塑料是一种简单的、可重复的以及可行的选择原始干细胞的方法，而不需要采取多种抗体标记步骤或者其它操作。本发明的CD34+细胞也能够粘附到玻璃上，且因此可使用玻璃或其它适当的固体支持物替代本发明方法中的组织培养级塑料。
本发明的干细胞在研究中有用，例如在检测和评估与干细胞再生相关的生长因子中。干细胞也可能通过基因修饰或自体干细胞的置换在遗传疾病的治疗中有直接的效用。特别是细胞可用于与造血细胞相关疾病的治疗，如β-地中海贫血和镰状细胞贫血，其中将野生型基因引入到干细胞中。因此，在另一个方面，本发明提供一种分离的成人干细胞群体，其中所述的干细胞是CD34+，能够自我再生并能够分化成造血细胞和间充质细胞，其进一步结合治疗性基因以用于治疗。
优选地，本发明提供一种分离的干细胞群体，其中所述干细胞是CD34+，能粘附到组织培养级塑料上并且能够自我再生以及能分化成造血细胞和间充质细胞，其进一步结合治疗性基因以用于治疗。同样地，本发明提供一种基因治疗的方法，其包括向所需患者施用干细胞群体，其中所述的干细胞是CD34+，能自我再生并且能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞以及结合治疗性基因。优选地，本发明提供一种基因治疗的方法，其包括向所需患者施用干细胞群体，其中所述的干细胞是CD34+，能粘附到组织培养级塑料上并能自我再生以及能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞并结合治疗性基因。
适当的治疗性基因将包括基因的野生型，其在患者中是缺陷的，或者是药物抗性基因。
不需要另外的治疗性基因，干细胞仍然具有治疗效用，例如，在再生缺乏干细胞的患者的造血系统中。
非常感兴趣的另一种效用涉及从本发明的干细胞中产生不同的分化的细胞类型。至此如在附图中所示，可能在有利地短时标内产生间充质细胞、造血细胞、内皮细胞、上皮细胞、管形成细胞以及树突形成细胞。特别优选地是制备造血细胞和间充质细胞。在少于14天后观察到具有肝脏细胞、神经细胞、间充质细胞、内皮细胞、上皮细胞和造血细胞外形的细胞。
依赖于所需的细胞类型，将干细胞与不同细胞因子的混合物培养。混合物一般地包括G-CSF、GM-CSF、IL-3以及干细胞因子，其中添加HGF和FGF以刺激肝细胞的分化；添加尼克酰胺和LY294002以刺激分化成胰细胞，以及添加FGF和二丁酰环AMP以促进产生神经细胞。其它生长因子是技术人员已知的，在其它细胞类型的分化中很重要，如骨、软骨、骨骼肌和心肌、肾、肺、神经、皮肤和内分泌组织。以这种方式生产的优选的细胞类型是肝细胞、胰细胞、造血细胞、神经元细胞和少突胶质细胞。
因此，在另一个方面，本发明提供一种生产靶细胞类型的方法，其包括与多种生长因子一起培养本发明的干细胞。如在实施例中所描述的和在附图中所显示的，成功的分化可通过视觉检查、流式细胞术、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)或者免疫分型来显示。除了表达CD34的细胞，还确定了例如表达清蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶和肝细胞生长因子受体(HGF受体-c-met)(肝细胞的特征)、波形蛋白(骨骼肌和神经元细胞)以及平滑肌肌动蛋白(肌细胞)的细胞。
分化细胞优选地将具有各种特征，例如，它们天然存在的对应细胞的形态和功能。然而，分化细胞可通过它们的同质性与天然存在的和分离的细胞区分开来，在这种情况下同质性是指细胞在正常细胞周期中的位置。本发明的这些分化细胞群体将基本上是同质的，即，所有成员大多数将是位于细胞周期中的相同点；相反，天然存在的细胞群体在这个方面将是异性的。
然后可将分化细胞移植到所需的患者中。特别有益的是产生从患者自身干细胞衍生的，用于细胞或组织移植的分化细胞的潜能。这种技术是本领域中已知的并根据特定的靶组织使用不同的施用途径。例如在引入健康的肝细胞群体后，肝脏能自我再生，其中肝脏已被损伤，例如，由于肝炎感染或酗酒引起的肝脏损伤。可通过施用淋巴细胞治疗免疫抑制，通过引入骨骼肌细胞治疗肌肉消瘦，通过移植胰细胞治疗糖尿病等等。
细胞可以局部的方式施用，例如，直接注射到靶器官如肝脏内。可选择地，细胞可在远离靶位点的部位施用，例如，通过静脉内送递。可通过在所产生的细胞类型和靶向配体之间形成复合体实现组织靶向，所述靶向配体如单克隆抗体、细胞粘附分子和它们的配体、细胞因子、趋化因子以及toll样受体和它们的配体。这种“复合体”包括在它们的表面上表达靶向配体的细胞。
本发明的干细胞可直接用于治疗方法，包括再生和修复的方法，细胞的分化可发生在体内。可用干细胞和分化细胞修复受损的器官和/或可能是器官再生，而且也可在器官未这样受“损伤”但结果不能以正常方式发育的情况中使用。“再生”因此应当被广泛地解释成包括器官生长或改善的所有方法。
在一个优选的实施方案中，使移植的细胞适于体内追踪，即它们结合标记部分，这意味着可在体内鉴定细胞的位置。方便地细胞将结合铁化合物，例如氧化铁，然后可使用MRI以确定移植细胞的位置，特别是用于确定它们是否已经到达它们的靶组织。如在实施例4中所描述的，MR试剂Resovist是合适的含铁化合物，在与其培养时其可被细胞摄入。
因此，根据另一个方面，本发明提供根据上述所定义的方法制备的分化细胞群体和用于治疗的这些细胞，以及包括向患者施用这些分化细胞群体的医学治疗的方法。具体地，本发明包括分化细胞群体的移植方法，该方法包括(i)与多种生长因子一起培养本发明的干细胞群体以便使其分化；和(ii)将所述分化的细胞移植到患者中。
优选地患者是人，且同样优选地，用于培养以产生分化细胞的干细胞来自患者。
从患者中采集标品以及生长成用于施用的分化细胞所需的较短时间是本发明所提供的特别益处。
本发明的干细胞和由其衍生的分化细胞也用于体外生产目的蛋白。因此，在另一个方面本发明提供一种体外生产蛋白的方法，其包括培养本发明的干细胞或从其衍生的分化细胞系，然后收获细胞以及回收由所述细胞表达的一种或多种蛋白。
动物细胞已成为体外生产靶蛋白，特别是治疗剂的主要蛋白表达系统，这是因为它们能进行蛋白的翻译后修饰(例如糖基化)。本发明的干细胞和它们的分化后代可用于绝大多数(如果不是全部的话)具有治疗重要性的蛋白的生产，如红细胞生成素、生长因子、蛋白激素如胰岛素等或者合成的蛋白。为了提供或提高特定靶蛋白的产量，可将细胞进行基因改造。然而本发明所赋予细胞类型的一个特别期望的特征是能分化成适当的细胞类型(例如，实质细胞)，从而使得细胞能天然地生产靶蛋白而不需要基因工程改造。
本发明细胞(干细胞和分化细胞)的上述用途也适用于非蛋白产物如类固醇，在两种情况中，适当的培养和收获技术对于技术人员来说是已知的。
本发明的干细胞具有必要的细胞机构以繁殖载体如腺病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒等；这是制备这种载体的动态药品生产管理规范(cGMP)的必需步骤。因此，在另一个方面，本发明提供如在这里所定义和描述的本发明的干细胞在载体，特别是病毒载体生产中的用途。可选择地考虑到，本发明提供一种载体生产的方法，其中目的载体在如这里所定义的和描述的本发明的干细胞中繁殖。载体(感染性试剂)一般是病毒载体如腺病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒。
将在下列非限制性的实施例中并参考附图进一步描述本发明，其中

图1-10是显示本发明的干细胞以及随着时间的推移，它们分化成间充质细胞(图3、5和6)、造血细胞(图4)、上皮样细胞(图7和8)、管形成细胞(图9)和树突形成细胞(图10)的照片。
图11是显示根据实施例4中所述的方案，CD34+细胞如何能够摄取Resovist(Schering AG)的照片。根据该图，单个点代表如下情况1、106细胞，0.25mmol Resovist，过夜温育2、106细胞，0.25mmol Resovist+珠，过夜温育3、106细胞，珠，过夜温育4、106细胞，阴性对照(未染色)5、5×105细胞，阴性对照(未染色)6、5×105细胞，0.25mmol Resovist，过夜温育7、5×105细胞，0.25mmol Resovist+珠，过夜温育8、5×105细胞，珠，过夜温育9、106细胞，0.25mmol Resovist，温育2小时10、106细胞，0.25mmol Resovist+珠，温育2小时11、106细胞，珠，温育2小时12、5×105细胞，0.25mmol Resovist，2小时13、温育5×105细胞，0.25mmol Resovist+珠，温育2小时14、5×105细胞，珠，温育2小时15、仅有珠，没有细胞图12是显示干细胞分化成肝细胞的照片，如通过存在肝细胞标记清蛋白和甲胎蛋白所证明的。
图13是显示在培养物温育的第7天向基本细胞因子(GM-混合物)(GM-混合物/基本细胞因子是G-CSF、GM-CSF、IL-3和干细胞因子的组合)添加肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)对细胞数目的影响高于在第0天或在第3天添加它们时对细胞数目影响的图。
图14是显示在基本细胞因子中维持60天的培养物中实际的和累积的细胞数目的图。
图15是培养7天后，证明细胞端粒酶活性的凝胶放射自显影图。
图16是通过免疫过氧化物酶免疫细胞化学显色的显微镜载玻片制剂的照片，显示了对照小鼠的肝不存在人细胞角蛋白18，但是在移植小鼠的肝中细胞角蛋白18呈阳性。
图17是通过免疫过氧化物酶免疫细胞化学显色的显微镜载玻片制剂的照片，显示了对照小鼠的肝不存在人清蛋白，但是在移植小鼠的肝中清蛋白呈阳性。
图18是三色免疫荧光图象的照片，显示了细胞角蛋白18和清蛋白的双重染色。
图19是对照和移植小鼠肝切片的照片，分别显示了不存在和存在用抗人核抗体染色的细胞。
图20是显示在移植小鼠的肝中人染色体的原位杂交分析的荧光的照片。
图21是显示深低温保藏不同血清浓度的新鲜分离的ASC34对它们随后在培养物中生长影响的图。
实施例A部分实施例1.细胞提取从正常个体的骨髓中或者动员的血液中获得用于移植目的的造血细胞。使用LymphoprepTM密度梯度从全部造血细胞中分离单核级分。使用MiniMACS技术从单核级分中分离CD34+细胞。将细胞首先用CD34单克隆抗体标记，然后用顺磁珠标记。将标记的细胞上样到在磁体上保持的柱上，洗脱未标记的细胞并通过从磁体上除去柱子释放标记的细胞。将CD34+细胞在37℃在组织培养塑料容器中温育至少2小时。通过用HBSS洗涤除去非粘附细胞。
实施例2.细胞培养将细胞(2×105/ml)在含有血清、100ng/ml粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、5ng/ml白细胞介素-3(IL-3)、20ng/ml干细胞因子(SCF)和1ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的甲基纤维素培养基中培养。该细胞因子的组合也可称作“基本细胞因子”或“GM-混合物”。这导致产生细胞的异质群体，其随后可被表征。然后使用定制的细胞因子混合物使所选的单个群体靶向于分化。
实施例3.流式细胞术和免疫细胞化学流式细胞术.通过刮平皿取出在培养物中已发育的粘附群体。将细胞在4％多聚甲醛中固定并透化。将细胞用与FITC缀合的单克隆抗体标记并使用Becton Dickinson流式细胞仪进行分析。
免疫细胞化学.通过刮平皿取出在培养物中已发育的粘附群体。将细胞离心(cytospun)到玻璃载玻片上并通过甲醇固定。将细胞用单克隆抗体标记并使用APAAP(碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶)反应进行显色。
在下面的表1中显示流式细胞术和免疫细胞化学的结果。
表1.
*表示群体中阳性细胞的％**表示群体中大细胞是阳性的并且小细胞是阴性的。
清蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶和c-MET(HGF受体)是肝细胞标记；GFAP(星形胶质细胞)是脑细胞标记；且平滑肌肌动蛋白是间充质细胞的标记。
图12显示培养12天后显现肝细胞标记的细胞。
实施例4.将氧化铁掺入到细胞中以及用顺磁珠标记细胞将CD34+(106和5×105)细胞在37℃与0.25mmol Resovist(Ferrixan的商标，可购自Schering AG的羧基-葡聚糖包被的氧化铁纳米颗粒(nanoparticle))温育2和24小时并用MRI进行分析。在两种情况中，通过MRI都获得阳性信号，从而提示Resovist在体内检测CD34+细胞中的可能用途。图11的结果表明颗粒可被细胞摄入，且因此当它们在体内运动或者位于靶组织中时，用于追踪CD34+细胞或者它们的分化后代。
也通过锥虫蓝排除测定检验Resovist的体外毒性，并证明其无显著性(＜4％)。
该试验的结果显示于图11中。
B部分(另外的实施例)实施例5ASC 34的来源通过吸引术从健康供体中获得的骨髓(BM)、通过白细胞提取法从给予一段时间粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的健康供体中获得的经过动员的外周血(PB)以及从正常足月分娩中获得的脐带血(UCB)是通常使用的ASC 34的来源。在所有病例中必需获得知情同意和研究伦理学委员会(Research Ethics Committee)批准。
已经在成人骨髓、足月脐带血、胎肝(妊娠11.6-13.8周龄)和胎儿骨髓(12.7-15.4周)以及成人造血组织和脐带血中检测到ASC-34活性。这些细胞与胚胎干细胞不同，因为认为胚胎在受精后8周形成胎儿。
实施例6粘附的CD34阳性人类干细胞(ASC34)同质群体的纯化干细胞初步纯化成同质是随后它们自我更新、分化和体内移入潜力研究所期望的。这种群体是通过连续的密度梯度分离、免疫磁珠选择以及差异粘附法获得的，并且对于CD34表达、粘附到组织培养级塑料或玻璃上以及小淋巴细胞样形态学方面是同质的。
通过经过Lymphoprep的密度梯度离心从整个样品中分离单核的细胞(MNC)级分，然后使用MiniMACS技术(Miltenyi Biotech)从MNC中分离CD34阳性细胞级分。对于这个，首先将细胞用抗CD34单克隆抗体标记，然后用顺磁微珠标记。将标记的细胞上样到在磁体上保持的柱上，洗脱未标记的细胞，然后通过从磁体上除去柱释放标记的细胞。将纯化的(＞98％)CD34阳性细胞在补充了15％血清的α培养基中稀释到2×105/ml。
通过在37℃将CD34阳性细胞悬浮液在组织培养塑料容器中温育至少2小时，获得粘附的CD34阳性干细胞(ASC34)。
通过在Hanks氏平衡盐溶液(HBSS)中洗涤组织培养容器，除去非粘附的CD34阳性细胞。
不管用于启始培养的造血组织(BM、PB、UCB)如何，粘附的CD34阳性干细胞最多占总CD34阳性细胞群体的约1％。未分化的CD34+粘附干细胞(ASC34)显示具有高的核胞质比的同质小淋巴样形态。在培养开始时，它们在组织培养表面如单个细胞一样被广泛地隔开。根据定义，起始细胞是CD34阳性的。如使用骨髓集落形成细胞的生产作为读数所测量的，用抗-Thy-1单克隆抗体的抗体排除实际上除去了粘附的CD34+细胞的所有活性；根据使用从6个独立的样品中所分离的细胞的免疫细胞化学结果，平均28.1％，但是最高90％的细胞表达Thy-1。它们也表达局限于核中的AC133和c-met，但不表达CD3或CD19。它们不表达CD33、CD38或HLA-DR。它们是非周期性的细胞，对用细胞周期活性药物5-氟尿嘧啶的处理有抗性。
表2证明在CD33、CD38和HLA-DR的表达方面，ASC34显著地比非粘附的CD34阳性细胞更同质。
表2在粘附的和非粘附的级分中抗原阴性的CD34阳性细胞的百分比
*平均值±sem(平均值的标准误)；**比较粘附的和非粘附的CD34+细胞的Mann-Whitney U检验；n＝检验的样品数实施例7使用对组织培养塑料的粘附作为选择标记对组织培养塑料的粘附是包括骨髓间充质干细胞、单核细胞和巨噬细胞的几种细胞类型的特征，但是这种特征以前一直没有用于表征CD34阳性细胞亚群。已发现对组织培养塑料的粘附是一种简单的，可重复的以及可行的选择原始干细胞的方法，而不需要采用多个抗体标记步骤或者其它操作。另一个优点是细胞利用塑料作为它们开始的生长基质并且纯化后不需要转移到独立的培养环境。
将在培养基中悬浮的CD34阳性细胞以每毫升5×105细胞的浓度引入到组织培养塑料容器中。将容器在37℃在潮湿的5％ CO2的空气中培养。通过用培养基彻底洗涤，除去占总CD34阳性群体99％的非粘附的CD34阳性细胞。ASC34很容易地结合玻璃，但不结合非组织培养级塑料。
可使用细胞刮棒通过机械性地将它们从组织培养塑料中取出来回收ASC34以用于进一步的研究或者操作。胰蛋白酶和accutase是无效的。
实施例8经过动员的血液作为粘附的CD34阳性人类干细胞(ASC34)的来源的用途可获得的用于启动培养的细胞数目是在从所培养的干细胞中进行组织再生发展过程中的一个限制性因素。骨髓和脐带血是有利的来源。然而，PBPC(外周血祖细胞)收获物产生更多的用于启动培养的细胞，因此降低放大的程度以及减少产生临床上有用产物所需的时间。
将供体(自体的或同种异体的)通过皮下施用5mg/kg G-CSF处理一周。使用程序化单采血液成分术机器通过白细胞提取法收获细胞。细胞的一般产量为5到10×1010，其中的绝大多数是单核的细胞，且约1％(5-10×108)是CD34+的。使用CliniMacs系统(MiniMacs的按比例扩大版)分离CD34阳性细胞。通过直接的观察，ASC34占CD34阳性群体的约1％(5-10×106)。这种估计通过ASC34活性的有限稀释分析得到证实，其中使用造血集落形成细胞测定作为读数。因此，在1-2周期间可获得3-4log扩大，将产生用于临床应用的5-100×109细胞。
实施例9ASC34的培养第二阶段条件培养的第一阶段由扩大粘附细胞组成。用含有血清(Methocullt H4230；Metachem Diagnostics，Northampton，英国)和细胞因子的基本混合物(100ng/ml G-CSF(Chugai Pharma，London，英国)1ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-3、20ng/ml SCF(所有都购自First Link，West Midlands，英国))的甲基纤维素覆盖ASC34。将培养物在37℃，5％潮湿的CO2空气中培养。ASC34分裂并自我更新形成粘附的干细胞集落，接着形成显示间充质、上皮、血管和神经细胞类型的形态学特征的粘附细胞。在培养的第一周中粘附细胞的数目增加40倍。另外，非粘附细胞释放到甲基纤维素内，其中发现了大量的造血细胞(白细胞)集落。
从培养环境中省略甲基纤维素将使细胞生产降低60％。将所接种的CD34+细胞数目提高到常规5×105/ml以上并不能导致细胞生产的同等增加。添加4mM氯化锂不能增加细胞数目。
第二阶段条件在第二阶段中，将细胞转移到液体培养条件中，其中根据需要添加另外的细胞因子以诱导选择性的细胞分化。下面列举用于不同地指导分化的适当的细胞因子。
表3指导分化的适宜条件
如在图13中可以看到的，一些细胞因子当在培养的第7天加入时比它们在第0天或第3天加入时更有效。表4显示不同的细胞因子和组合对两周龄培养物中的总细胞数目的影响。
表4不同的细胞因子和细胞因子组合对细胞产量的影响*.
*相对于仅有GM混合物的细胞产量，即存在所添加的细胞因子时的细胞产量仅存在GM混合物时的细胞产量之间的比数据显示，额外的细胞因子总的说来对细胞的数目没有较大影响。更重要地是，所设计的用于诱导分化的组合(HGF+EGF+β动物纤维素+活化素A/KGF+尼克酰胺+葡萄糖)不降低细胞产量。
可将培养物在第二阶段条件中维持60天(图14)。
实施例10端粒酶活性使用TRAP测定来测量端粒酶活性。将细胞转移到1×CHAPS缓冲液中，并使用DC测定(Bio-Rad)测定所得裂解液的蛋白浓度，所述裂解液标准化到77ng/μl并用CHAPS缓冲液以1∶10、1∶40和1∶160稀释。将裂解液使用TRAPeze端粒酶检测试剂盒(Intergen)进行分析。将TS引物在37℃标记20分钟并在85℃热变性5分钟。然后运行PCR，进行28个循环，其中退火温度为59℃。将得到的TRAP产物在TRAP上样染料中稀释并在12.5％丙烯酰胺-0.5×TBE凝胶上进行电泳，干燥并曝光于X光胶片。
在培养开始时，如通过TRAP测定所评估的，细胞不表达端粒酶活性，这与细胞在分离时的休眠性质一致。从7天龄培养物开始，细胞中的端粒酶活性非常显著(图15)，这与细胞在该阶段的增殖一致。
实施例11聚合酶链反应从ASC34(第0天)中和从在基本细胞因子或者在添加如在图例中所示的HGF或EGF培养7天和14天后ASC34衍生的细胞中制备裂解液。在另一个实验中，对培养中的细胞分析最多35天。从培养细胞的粘附的和非粘附的细胞级分中制备单独的裂解液。通过PCR分析基因表达。
在第0天ASC 34的基因表达自我更新和多潜能标记。
Rex-1氧化还原传感转录阻抑物Oct 4八聚体结合转录因子-4Nanog促进ES细胞自我更新的同源域蛋白造血细胞标记CD34 造血干细胞标记CD133胆固醇结合蛋白prominin 1。脂质筏标记。
RECAM血小板-内皮粘附分子VWF von Willibrand因子。凝固TAL-1T细胞急性白血病-1。碱性螺旋-环-螺旋蛋白CXCR4SDF-1的趋化因子受体。对干细胞归巢和移入很重要血管生成素1 Tie 2的配体。维持造血干细胞休眠Tie 2血管生成素-1的受体。维持造血干细胞休眠。
骨骼肌标记TNNT1骨骼慢肌钙蛋白1结蛋白 肌肉的主要中间丝蛋白伴肌动蛋白横纹肌肌节丝的结构成分心脏连接蛋白-43 心肌细胞中的间隙连接成分GATA-4心肌细胞中结合FOG2的锌指转录因子神经CXCR4 神经前体上SDF-1的趋化因子受体连接蛋白-43 星形胶质细胞上的间隙连接成分内皮CD34 造血干细胞标记。也由内皮细胞表达CD133 胆固醇结合蛋白prominin 1。脂质筏标记VEGF 血管内皮生长因子KDR 激酶插入结构域受体。VEGF的受体血管生成素1 血管生成因子。Tie 2的配体血管生成素2 血管生成因子。Tek的配体Tie 2 血管生成素1的受体CXCR4 SDF-1的趋化因子受体。对于血管形成很重要PECAM 血小板-内皮细胞粘附分子ICAM 2细胞间粘附分子2。介导白细胞外渗VE钙粘着蛋白 形成粘着连接TAL-1 T细胞急性白血病-1。
VWF von Willibrand因子。凝固因子肝脏α-1抗胰蛋白酶细胞角蛋白18巢蛋白波形蛋白c-met 肝细胞生长因子的受体CD34 造血干细胞抗原。也在候选的肝脏干细胞上表达。
胰NGN-3 β细胞分化中pdx-1的靶培养14天后由ASC 34所产生的细胞的基因表达。
造血细胞标记CD133 胆固醇结合蛋白prominin 1。脂质筏标记PECAM 血小板-内皮细胞粘附分子VWFvon Willibrand因子。凝固TAL-1 T细胞急性白血病-1。碱性螺旋-环-螺旋蛋白CXCR4 SDF-1的趋化因子受体。对干细胞的归巢和移入很重要血管生成素1Tie 2的配体。维持造血干细胞休眠骨骼肌标记伴肌动蛋白 巨大细胞骨架蛋白。横纹肌肌节丝的结构成分心脏肌钙蛋白1 肌钙蛋白复合物的亚基伴肌动蛋白 巨大细胞骨架蛋白神经CXCR4 神经前体上的SDF-1的趋化因子受体内皮CD133 胆固醇结合蛋白prominin 1。脂质筏标记VEGF 血管内皮生长因子血管生成素1血管生成因子。Tie 2的配体血管生成素2血管生成因子。Tek的配体CXCR4 SDF-1的趋化因子受体。对于血管形成很重要PECAM 血小板-内皮细胞粘附分子ICAM 2 细胞间粘附分子2。介导白细胞外渗VWFvon Willibrand因子。凝固TAL-1 T细胞急性白血病-1。碱性螺旋-环-螺旋蛋白伴肌动蛋白 巨大细胞骨架蛋白肝脏α-1抗胰蛋白酶 蛋白酶抑制剂细胞角蛋白18 细胞骨架成分LDLR 低密度脂蛋白受体。在胆固醇稳态中起作用清蛋白 类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白
HGF肝细胞生长因子HNF3-B 肝细胞核因子3β。转录因子运铁蛋白 铁转运AFP甲胎蛋白胰Pax-6Pdx-1胰岛素 抵抗高血糖并刺激脂肪生成IGF-1 胰岛素样生长因子1。生长调节素HNF3-B 肝细胞核因子3β。在产生胰高血糖素的胰岛细胞中所表达的转录因子。
NeuroD-1 调节胰岛素基因表达NGN3每周研究一次在基本细胞因子(GM-混合物)中培养的细胞所表达的胰岛素、PDX-1、Neuro D-1和NGN3基因的表达。结果显示从第7天到第35天表达胰岛素，从第7天到第35天表达PDX-1，从第14天到第35天表达NeuroD-1以及从第21天到第35天表达NGN3。因此，在胰岛素生产中所涉及的基因的表达持续3-4周，其中最广泛的表达发生在培养3-5周龄。因此在本发明的优选实施方案中，干细胞能产生后代，其表达胰岛素生产中所涉及的基因(胰岛素、PDX-1、Neuro D-1和NGN3)。
实施例12ASC34分化成造血细胞将14天后将从培养物中收获的细胞铺平板到标准造血集落形成细胞测定中。一般地，～103粒细胞-巨噬细胞集落形成，代表培养物中总细胞的～1％。当收获ASC34衍生的细胞并在造血集落测定中生长时，红细胞类的BFU-e、巨核细胞(Mk-CFC)和多潜能(GEMM)集落形成细胞也很明显。更重要地是，ASC34引起形成骨髓基质粘附的干/祖细胞，其当接种到预先形成的培养基质上时形成母细胞集落/“鹅卵石(cobblestone)”区并且在延长的体外温育(5周)期间能长期产生造血细胞。
制备细胞的细胞离心(Cytospin)制剂并用Romanowsky细胞化学染料染色。这揭示了粒细胞、单核细胞-巨噬细胞、巨核细胞(mekakaryocytic)以及类红细胞分化的形态学证据。
实施例13移入动物模型中实验1将大量的(1×106)ASC34衍生的细胞静脉内或皮下注射到裸鼠中不导致任何死亡率或可看得出的发病率。
实验2已用肝脏毒素(1g/kg硫代乙酰胺)处理过的裸鼠接受1×106ASC34衍生的细胞，包括通过直接注射到脾内的候选肝细胞。毒素的裸鼠受体仅作为对照。到第7天所有对照小鼠均死亡，而所有的细胞受体均存活，与它们是否已用环孢菌素(CsA)处理过无关(表5)。
表5将ASC34衍生的细胞移植到具有肝脏损害的小鼠中的结果
*肝脏毒素实验3设置三个实验组第1组，TA+细胞；第2组，TA+CsA+细胞；第3组，仅TA。向第2组动物每周施用两次CsA。第3组中的所有小鼠在用TA处理后2天内均死亡。第1组和第2组中的动物存活，直到被处死用于组织采样(第1、8和15天)。第2组小鼠的肝脏切片对于人类细胞角蛋白18，一种证明存在人类ASC34衍生细胞的肝特异性标记，染色呈阳性。在对照动物的切片上没有观察到染色(图16)。
实验4使用抗-Fas抗体JO2诱导进行性慢性肝衰竭。每个动物持续4周接受250μg JO2/kg/周，且第一次JO2注射后24小时脾内注射1×106细胞。每周给予两次CsA。在12只动物中，2天后有2只发生与手术有关的死亡，且一只动物存活了82天。将剩余的小鼠处死以进行检查(一只在第2天，两只在第8天，三只在第13天以及三只在第21天)。
在图16-20中所显示的分析证明，人类细胞移入小鼠的肝脏中并且产生清蛋白和细胞角蛋白18。
实施例14深低温保藏和贮藏在深低温保藏小瓶中将细胞(回收的粘附的CD34阳性级分或在培养中所产生的它们的后代)悬浮于30％血清/10％ DMSO中并置于-80℃的乙醇冷冻浴中过夜。然后将冷冻小瓶转移到液氮的蒸气相中用于贮藏。通过将小瓶在37℃水浴中迅速解冻，从冷冻的状态中回收细胞，将内容物用培养基稀释并洗涤细胞。
在处理前，可将白细胞提取法产物在37℃贮藏24小时，对后来的体外生存力或生长没有任何有害影响(数据没有显示)。当在10％DMSO加30-50％血清中深低温保藏前对粘附细胞进行纯化，再解冻时它们仍然保持92±4.8％(平均值±SD)的生存力并且对它们在体外的生长没有影响(图21)。
这些结果具有实际的含意1.处理前处理前可将白细胞提取法产物在4℃贮藏24小时。因此，可将冷却的白细胞提取法产物全世界范围内从保藏中心运输到加工中心。
2.纯化后可将ASC34悬浮于10％ DMSO/30-50％血清中并在液氮中冷冻。解冻后它们保持90-100％生存力，像新鲜细胞一样重新粘附到组织培养塑料上并在培养中增殖。因此，分离的有功能的ASC34可全世界范围内运输或长期贮藏。
3.培养后将培养14天的细胞进行深低温保藏、解冻和再培养。可将培养14天的细胞放置在环境温度中并保持生存力。因此，培养的细胞可全世界范围内运输或者长期贮藏。
实施例15ASC-34和间充质干细胞(MSC)之间差异的总结间充质干细胞是可从成人骨髓中衍生的独立的细胞群体。MSC(也称作多潜能成人祖细胞-MAPC)和ASC-34细胞(本发明的细胞)显示下面所总结的很重要的差异。也应当注意到MSC/MAPC细胞不表达CD34。
*参考文献Javazon，Beggs和Flake.Exp Hematol 2004，32414.
1-MAPC仅在延长培养后被发现。它们一直没有在新鲜骨髓样品中被鉴别。
2-ASC-34细胞对5氟尿嘧啶有抗性
权利要求
1.一种分离的干细胞群体，其中所述的干细胞是CD34+，能自我再生，能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞并且能够粘附到组织培养级塑料上。
2.根据权利要求1的细胞群体，进一步的特征是细胞在分离后的3小时内能粘附到组织培养级塑料上，并且保持粘附至少72小时。
3.根据权利要求1或2的干细胞群体，其中所述细胞是CD33-、CD38-、HLA-DR-、CD3-和CD19-。
4.根据前面任何一项权利要求的干细胞群体，其富集了也是Thy-1+的细胞。
5.根据前面任何一项权利要求的干细胞群体，其富集了也是AC133+和/或c-met+的细胞。
6.根据前面任何一项权利要求的干细胞群体，其表达编码Rex-1、Oct4、Nanog、CD34、CD133、PECAM、VWF、Tal-1、CXCR4、血管生成素1、Tie2、TNNT1、结蛋白、伴肌动蛋白、连接蛋白-43、GATA-4、VEGF、KDR、血管生成素2、ICAM-2、VE钙粘着蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、巢蛋白、波形蛋白和c-met的基因。
7.根据前面任何一项权利要求的干细胞群体，培养后所产生的其后代表达编码CD133、PECAM、VWF、Tal-1、CXCR4、血管生成素-1、伴肌动蛋白、肌钙蛋白1、VEGF、血管生成素2、ICAM2、α-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、LDLR、清蛋白、HGF、HNF-3β、运铁蛋白、甲胎蛋白、Pax-6、Pdx＝1、胰岛素、IGF-1、NeuroD-1和NGN3的基因。
8.根据前面任何一项权利要求的干细胞群体，其后代表达胰岛素生产中所涉及的基因。
9.根据权利要求1-8中任何一项的干细胞群体，其中所述干细胞是成人干细胞。
10.根据权利要求1-8中任何一项的干细胞群体，其中所述干细胞群体包括从非胎儿样品，如脐带样品中获得的胎儿细胞。
11.根据前面任何一项权利要求的干细胞群体，其中所述细胞具有在ECACC中保藏的，登记号为No.04092401的那些细胞的特征。
12.根据前面任何一项权利要求的干细胞群体，其是哺乳动物来源的。
13.根据前面任何一项权利要求的干细胞群体，其是人来源的。
14.根据权利要求1-12中任何一项的干细胞群体，其是鼠、马或牛来源的。
15.根据权利要求1-12中任何一项的干细胞群体，其是分离自或衍生自从伴侣动物中所采集的样品的。
16.根据前面任何一项权利要求的干细胞群体，在其培养期间不需要饲养层。
17.一种能自我再生并分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞的分离的干细胞群体，所述的群体可通过下列方式获得(i)将造血组织进行密度梯度分离；(ii)使低密度细胞接触CD34的亲和配体；(iii)回收附着到所述CD34配体上的细胞；(iv)使CD34+亚群接触组织培养级塑料；和(v)回收粘附所述塑料的CD34+细胞。
18.一种培养物，其包括(i)干细胞群体，其中所述的干细胞是CD34+，能粘附组织培养级塑料，能自我再生并能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞；和(ii)能支持所述干细胞生长的培养基。
19.一种分离干细胞群体的方法，其中所述的干细胞是CD34+，能粘附组织培养级塑料，能自我再生并能分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞，其中该方法包括从受试者中采集血液或骨髓样品以及从中提取所述的细胞群体。
20.如在权利要求19中所要求保护的分离方法，其包括(i)将造血组织进行密度梯度分离；(ii)使低密度细胞接触CD34的亲和配体；(iii)回收附着到所述CD34配体上的细胞；(iv)使CD34+亚群接触固体支持物；(v)回收粘附所述固体支持物的CD34+细胞。
21.根据权利要求20的方法，其中所述固体支持物选自组织培养级塑料或玻璃。
22.如在权利要求19或20中所要求保护的方法，其进一步包括培养所述分离的干细胞群体的步骤。
23.一种生产靶细胞群体的方法，其包括与多种生长因子一起培养如在权利要求1-17中任何一项所限定的干细胞群体，这导致所述干细胞群体的分化。
24.如在权利要求23中所要求保护的方法，其中所述靶细胞选自肝细胞、胰细胞、造血细胞、神经元细胞以及少突胶质细胞。
25.一种培养如在权利要求1-17中任何一项所限定的干细胞群体的方法，其包括使所述细胞群体与多种生长因子接触，这促进和/或维持所述干细胞群体的增殖。
26.通过如在权利要求19-25中任何一项所要求保护的方法生产的细胞群体。
27.如在权利要求1-17和26中任何一项所要求保护的细胞群体，其中细胞能在深低温保藏下存活。
28.如在权利要求1-17、26或27中任何一项所要求保护的细胞群体，其中通过插入核酸区改变基因组。
29.权利要求28的细胞群体，其中通过使用DNA病毒、RNA病毒或逆转录病毒载体插入DNA而改变基因组。
30.如在权利要求1-17、26或27中任何一项所要求保护的细胞群体，其中部分基因组已灭活，例如，通过存在反义核酸分子、核酶序列或抑制性RNA序列。
31.如在权利要求1-17或26-30中任何一项所要求保护的细胞群体，其用于治疗。
32.如在权利要求1-17或26-30中任何一项所要求保护的细胞群体，其用于再生器官或修复受损器官。
33.一种再生患者器官或修复患者受损器官的方法，其包括向所述患者施用根据权利要求1-17或26-30中任何一项的细胞。
34.根据权利要求32或权利要求33的细胞群体或方法，其中所述器官选自造血系统或免疫系统、肝脏、肺、胰、骨、软骨、肌肉、皮肤、脑或神经系统以及心脏或循环系统。
35.根据权利要求32-34中任何一项的细胞群体或方法，其中将所述细胞用可追踪的标记进行标记，优选地用氧化铁或顺磁珠。
36.一种细胞移植的方法，其包括将如在权利要求1-17或26-30中任何一项所要求的细胞群体引入到受试者中。
37.一种筛选试剂的器官特异性作用的方法，其通过将由如在权利要求23或24中所要求保护的方法所产生的细胞与所述试剂接触来进行。
38.根据权利要求37的方法，其中所述试剂是怀疑有器官特异性毒性的毒素。
39.根据权利要求37的方法，其中所述试剂是怀疑有器官特异性毒性的药物或治疗剂。
40.根据权利要求37的方法，其中所述试剂是怀疑有有益的器官特异性作用的药物或治疗剂。
41.一种体外产生蛋白的方法，其包括培养权利要求1-17中任何一项的干细胞或者从其衍生的分化细胞系，以及回收由所述细胞所表达的一种或多种蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种分离的干细胞群体，其中所述的干细胞是CD3文档编号A61K35/12GK1918284SQ200480041764
公开日2007年2月21日 申请日期2004年12月20日 优先权日2003年12月19日
发明者M·戈顿, N·哈比布 申请人:奥姆尼赛特有限公司