专利名称：基于足细胞粘附的抗早期糖尿病肾病药物筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选药物的方法，尤其涉及一种基于足细胞粘附性的实时动态高通量筛选抗早期糖尿病肾病药物的方法。
背景技术：
药物的应用是十分复杂的研究，提高药物的准确应用在医药研究中具有重要意义。药物筛选是指对投入应用的药物需要筛选并对药物价值的评价，筛选的样品越多，发现针对性强、合适的药物的可能性越大，因此高通量药物筛选技术成为目前药物筛选的重要
Tno高通量筛选技术(High-throughput Screening, HTS)是20世纪80年代后期形 成的寻找药物的高新技术，是应用先进的分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化控制等高新技术，建立的一套更适合于药物筛选的技术系统。高通量筛选技术以分子和细胞水平的实验方法为基础，以微孔板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以计算机对实验获得的数据进行分析外理，在同一时间内可以对数以万计的样品进行快速检测。高通量药物筛选采用的筛选模型是体外微量实验方法，主要是分子和细胞水平的评价方法，而不是传统的动物实验或组织器官实验方法，这种微量实验方法减少了样品试剂材料的消耗，减低了筛选成本，但需要检测方法具有较高的特异性和灵敏性。糖尿病肾病是临床常见和多发的糖尿病并发症。是糖尿病最严重的并发症之一，糖尿病肾病为糖尿病主要的微血管并发症，主要指糖尿病性肾小球硬化症，一种以血管损害为主的肾小球病变，随着糖尿病患者数量的不断增加，对抗早期糖尿病肾病的药物的研究和寻找越发重要。尤其对于中药来讲，虽然具有毒副作用小等优势，但是中药种类繁多，而且对其功能研究不够充分，因此如何在众多中草药中选择出能够抗早期糖尿病肾病的药物并不容易，因此找出一种能够快速筛选抗糖尿病肾病药物的方法不仅对糖尿病肾病的治疗非常关键，同时也对中药开发和利用有着重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种基于细胞粘附性的抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法，所述筛选药物的方法为采用xCELLigence系统联合流式细胞仪检测技术、建立基于足细胞粘附的实时动态高通量药物筛选方法，在细胞及分子水平筛选抗早期糖尿病肾病药物，并能够通过动态检测足细胞粘附，达到实时观测细胞生长、药物效应起始时间点与最大作用时间点的目的。本发明抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法包括以下步骤
步骤1，将足细胞种植于培养板中，建立高糖刺激下的足细胞病理模型，将待筛选药物加入到已种植所述足细胞的培养板中；优选地，所述高糖刺激下的足细胞病理模型中，含有D-葡萄糖 30mmol/L。
步骤2，采用xCELLigence系统对加入待筛选药物的足细胞粘附性进行实时动态监测，并设立不加任何药物的高糖对照组和正常糖对照组；优选地，所述高糖对照组中，含有甘露醇25mmol/L，D-葡萄糖5mmol/L。步骤3，选出能够增加足细胞粘附性的药物。步骤4，采用流式细胞仪对加入步骤3中所选出药物的样品细胞a j I整合素表达进行检测；
步骤5，选出能增加a 整合素表达的药物。上述筛选药物的方法中，所述待筛选药物包括天然药物以及中药单体。
上述筛选药物的方法中，步骤2中所述足细胞置于铺有基底复合膜的96孔板中，所述样品细胞密度为3X IO4个/孔。所述基底复合膜为能够模拟人体肾小球基底膜的物质。上述筛选药物的方法中，步骤4中所述足细胞置于铺有基底复合膜的96孔板中，所述样品细胞密度为3 X IO4个/孔。上述筛选药物的方法中，步骤2中所述实施动态检测为每隔6分钟对足细胞粘附性进行检测。上述筛选药物的方法中，步骤2中所述实施动态检测还包半数有效浓度的计算，以及药物效应起始时间点、最佳作用时间、药物最佳剂量、有效剂量的检测。其中，所述最佳作用时间指的是足细胞粘附性增至最大时的时间，最佳剂量指的是能够增加足细胞粘附性的最小毒性剂量。本发明基于细胞粘附性的抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法，优点在于
I)本发明抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法可以在分子水平上对单细胞进行定量分析和分选，高速分析上万个细胞，并能同时测得细胞中多个参数，进行快速的高通量筛选，适用于高通量筛选抗早期糖尿病肾病药物，极大加速抗早期糖尿病肾病新药的发现进程。2)本发明抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法无需标记和破坏细胞，因此不需要费力且成本高的细胞标记及细胞裂解或固定。3)本发明抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法可实时观测足细胞生长、药物效应起始时间点与最大作用时间点，并提供不同时刻足细胞粘附半数有效浓度(EC50)，实现实时动态、准确高效筛选增加足细胞粘附的化合物，改变了传统细胞分析只能仅仅提供最终结果的终端形式。4)本发明抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法，经动物实验和Z’因子分析证明具有稳定性和可靠性。综上，本发明提供的基于细胞粘附性的抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法具有无损伤、实时动态检测、信息量大，而且过程简洁、重复性好的特点，适用于抗早期糖尿病肾病药物的高通量筛选。
图I为采用本发明方法筛选所得药物黄芪甲苷减轻足细胞脱落的治疗效果；
图2为采用本发明方法筛选所得药物黄芪甲苷降低尿白蛋白的治疗效果。
具体实施例方式本发明所公开的是一种抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法，通过采用xCELLigence系统的技术建立基于足细胞粘附的实时动态高通量药物筛选方法，在细胞水平初筛增加足细胞粘附的化合物，动态检测足细胞粘附，实时观测细胞生长、药物效应起始时间点与最大作用时间点；而使用流式细胞仪在分子水平上对单细胞进行定量分析和分选，高速分析上万个细胞并同时监测细胞中的多个参数。所述xCELLigence系统采用罗氏与ACEA Biosciences公司联合开发的细胞分析仪。流式细胞仪则是对细胞进行自动分析和分选的装置，它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。本发明所提供的基于细胞粘附性的抗早期糖尿病肾病药物的筛选方法，操作步骤 如下
步骤1，将足细胞种植于培养板中，建立高糖刺激下的足细胞病理模型，将待筛选药物加入到已种植所述足细胞的培养板中；
步骤2，采用xCELLigence系统对加入待筛选药物的足细胞粘附性进行实时动态监测，并设立不加任何药物的高糖对照组和正常糖对照组；
步骤3，选出能够增加足细胞粘附性的药物；
步骤4，采用流式细胞仪对加入步骤3中所选出药物的样品细胞a j i整合素表达进行检测；
步骤5，选出能增加a 整合素表达的药物。下面通过具体实施例，对本发明筛选方法进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述具体实施例并不限制本发明范围。步骤1，培养瓶预先经0. lmg/ml胶原I在37°C处理I小时，足细胞生长在含IOU/ml Y-干扰素、10%胎牛血清、100U/ml青链霉素、lOOl^g/ml链霉素的RPMI1640培养液中，在5%C02、33°C培养孵箱传代培养；然后转入37°C、5%C02培养孵箱分化后进行实验。生长状态良好的足细胞种植于经胶原I处理的培养板中，然后建立高糖(30mmol/L D-葡萄糖)刺激下的足细胞病理模型，同时设立正常糖对照组(5mmol/L D-葡萄糖)及高渗对照组(25mmol/L 甘露醇 + Smmol /T, D-葡萄糖)。采用基底膜复合物(BMC)模拟人体肾小球基底膜(GBM)成分，将生长状态良好且已分化的足细胞种植于铺有BMC的培养板中。BMC是从小鼠组织中提取的一种可溶性基底膜蛋白复合物，主要成分为层粘连蛋白、IV型胶原及硫酸肝素蛋白聚糖，它与人体GBM的成分基本类似，为研究足细胞粘附功能提供了模拟人体内的生理环境。步骤2，将liig/ml BMC铺于96孔板在4 °C过夜，用PBS轻轻冲洗，加入各实验组足细胞，平均细胞密度为3X IO4ceIls/孔，然后加入不同中草药及其单体，采用xCELLigence系统检测足细胞粘附，该系统可以每6分钟一次实时动态监测足细胞粘附，还可最后计算半数有效浓度(EC50)，利用该系统实时动态、准确高效筛选增加足细胞粘附的化合物。步骤3，筛选出能够增加足细胞粘附性的有效成分，从而通过细胞水平进行初步筛选得到部分药物。步骤4，将生长状态良好的贴壁生长的足细胞用0. 25%胰酶消化，室温，IOOOrpm离心5 min，将细胞悬浮，密度为IX 105/ml，种植于铺有I y g/ml基底膜复合物的96孔板中，平均细胞密度为3X IO4ceIls/孔，加入步骤3中筛选出的药物，然后分别加入含5 u g/mL一抗anti-a j i整合素的PBS100W，阴性对照孔中则加入相应同型匹配的对照抗体,37°C放置45min ;细胞用PBS轻轻冲洗3次，然后加入10 u g/mL FITC标记二抗，室温培养30分钟，标记的细胞再用PBS冲洗，最后用流式细胞仪进行分析
步骤5，最后筛选出能够增加a i整合素表达的药物，从而通过分子水平检测得到符合要求的a 3 P工整合素受体激动剂。同时本发明还可以对筛选条件进行优化，如适当的细胞数目、药物效应起始时间点与最大作用时间点、药物最佳作用浓度及最小毒性剂量的选择等，均可通过实时检测得到。筛选方法的评估为了确认筛选系统是否符合高通量筛选的要求，采用V因子 分析法来进行评估高通量筛选系统的稳定性和可靠性，其计算公式如下
权利要求
1.一种基于足细胞粘附的抗早期糖尿病肾病药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1，将足细胞种植于培养板中，建立高糖刺激下的足细胞病理模型，将待筛选药物加入到已种植所述足细胞的培养板中； 步骤2，采用xCELLigence系统对加入待筛选药物的足细胞粘附性进行实时动态监测，并设立不加任何药物的高糖对照组和正常糖对照组； 步骤3，选出能够增加足细胞粘附性的药物； 步骤4，采用流式细胞仪对加入步骤3中所选出药物的足细胞a i整合素表达进行检测； 步骤5，选出能增加a 整合素表达的药物。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤4中所述足细胞置于96孔板中，所述样品细胞密度为3 X IO4个/孔。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2中所述足细胞置于96孔板中，所述样品细胞密度为3 X IO4个/孔。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2中所述实施动态检测为每隔6分钟对足细胞粘附性进行检测。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2中所述实施动态检测还包括半数有效浓度的计算。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2中所述实施动态检测还包括药物起效时间和/或有效剂量的检测。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2中所述实时动态检测还包括药物最佳作用时间和/或最佳剂量的检测。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2所述高糖对照组中，含有甘露醇25mmol/L, D-葡萄糖 5mmol/L。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I所述高糖刺激下的足细胞病理模型中，含有D-葡萄糖30mmol/L。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述待筛选药物包括天然药物和中药单体。
全文摘要
本发明提供一种基于足细胞粘附的抗早期糖尿病肾病药物筛选方法，通过采用xCELLigence系统在细胞水平初筛增加足细胞粘附的化合物；进一步结合流式细胞仪在分子水平上对单细胞进行定量分析和分选，进一步保证筛选的准确性。所述实时动态高通量筛选抗早期糖尿病肾病药物的方法具有无损伤、实时动态检测、信息量大且过程简洁、重复性好的特点。
文档编号C12Q1/06GK102798588SQ20111013267
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月23日 优先权日2011年5月23日
发明者汪年松, 桂定坤, 王筱霞, 王 锋, 范瑛 申请人:上海市第六人民医院