专利名称：一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及通过基因定点突变的方法获得葡萄糖耐受浓度提高的β -葡萄糖苷酶基因、突变质粒、工程菌及突变酶。
背景技术：
β -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)属于外切水解酶类，是一类在亲核分子间催化转移糖苷的酶，可以在短链的寡糖或纤维二糖内部、在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间打断β_1，4-糖苷键。葡萄糖苷酶是一类重要的工业用酶，潜在应用广泛，在众多生物技术生产过程中具有重要的应用价值。它是食品工业中重要的风味酶，可以水解水果中的风味前体物——β -糖苷，释放出挥发性糖苷配基，充任水果风味增香酶的角色； β -葡萄糖苷酶兼具有糖苷转移酶的活性，可以用于合成新的糖配体；β -葡萄糖苷酶可以与其他几种纤维素降解酶协同作用，将纤维素降解成葡萄糖，后者能为产能微生物利用，进而炼制生成燃料乙醇等能源物质。一般情况下，β-葡萄糖苷酶对其水解产物葡萄糖异常敏感，极低浓度的葡萄糖就能够反馈抑制葡萄糖苷酶的活性。葡萄糖苷酶对葡萄糖的抑制常数 Ki 一般为 0. 5mM-100mM(ffatanabe Τ, Sato S, Yoshioka Τ, et al. Purification and properties of Aspergillus niger β-glucosidase. J. Biochem. 1992, 209 :651-659 ； Woodward J and Wiseman A. Fungal and other β —D—glucosidases their properties and applications. Enzyme Microb. Technol. 1982,4 :73-79.)，仅有极少数的 β _ 葡萄糖苷酶具有较高的葡萄糖耐受浓度(Christine R，Jean-Michel S，Marie-Jose V, et al. Purification, characterization, and subatrate specificity of a novel highly glucose-tolerant β -glucosidase from Aspergillus niger.Applied and Environmental Microbiology. 1998,64(10) :3607-3614.)。在 β-葡萄糖苷酶工业应用过程中，人们发现，非葡萄糖敏感的β -葡萄糖苷酶降解纤维素的速度更快，可以改善木质纤维素的发酵工艺；并且，利用葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶，可生产出20-30% 农 it 的胃 ^f (ffaldron CR, Becker-Vallone CA, and Eveleigh DE. Isolation and characterization of a cellulolytic actinomycete Microbispora bispora. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986，24:477-486.)。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种运用定点突变的方法获得的选择性突变的 β-葡萄糖苷酶突变体。本发明的第二个目的在于提供一种编码如上述的β -葡萄糖苷酶突变体的DNA序列及其突变质粒。本发明的第三个目的在于提供一种转化有上述重组表达质粒的葡萄糖苷酶生产菌株。本发明的第四个目的在于提供一种利用上述葡萄糖苷酶生产菌株生产的 β-葡萄糖苷酶的突变体。本发明的β -葡萄糖苷酶突变体，氨基酸序列如以下任意一项所述A)、SEQ ID No. 1所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第184位的组氨酸突变为苯丙氨酸；B)、SEQ ID No. 1所示的所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第409位的亮氨酸突变为谷氨酸。C)、SEQ ID No. 1所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第184位的组氨酸突变为苯丙氨酸，第409位的亮氨酸突变为谷氨酸。本发明的一种β -葡萄糖苷酶突变体，所述突变体的氨基酸序列还可以包括序列中的无义突变或同义突变的组合。本发明提供一种突变质粒，包含上述编码有所述β -葡萄糖苷酶突变体的DNA序列。本发明还提供一种具有β -葡萄糖苷酶合成性能的工程菌，所述工程菌含有上面所述的突变质粒，所述β-葡萄糖苷酶突变体由工程菌发酵获得。下面介绍下本发明β -葡萄糖苷酶突变体的获得首先以来自多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的β -葡萄糖苷酶与葡萄糖复合物的结构作为模板，利用Swiss-Model建模海洋未培养微生物来源的葡萄糖苷酶(BgllA)，并通过叠加获得BgllA与葡萄糖复合物的结构，从而获得相应的与葡萄糖结合的氨基酸残基位点。根据海洋未培养微生物来源的β -葡萄糖苷酶(BgllA)的基因序列，设计并合成突变引物，再以包含海洋未培养微生物来源的葡萄糖苷酶基因的重组质粒为模板质粒，以上述的合成突变引物为引物，基于PCR的方法进行定点突变，从而获得葡萄糖耐受性能提高的葡萄糖苷酶的突变基因。将突变DNA与pMD18-T质粒连接并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，挑取阳性克隆，对突变基因进行DNA序列测定。挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有突变β-葡萄糖苷酶基因的PMD18-T重组质粒，用Nde I和Bio I双酶切所得的pMD18_T重组质粒和表达质粒载体，然后用T4 DNA连接酶将酶切后的突变基因与表达质粒载体连接，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到含有本发明突变基因的工程菌株。上述构建方法中所述表达质粒载体指pCold、pET15、pET22或pED8等。上述构建方法中所述宿主菌是指E. coli BL21(DE3)、E. coli DH5a、E. coli JM109 或 Ε. coli Rosetta 等。将获得的含有突变基因的工程菌进行发酵培养，并纯化获得β -葡萄糖苷酶突变酶蛋白。对突变酶蛋白和原始野生型蛋白的葡萄糖耐受性能、最适ρΗ、ρΗ稳定性、最适温度和温度稳定性等进行了测定和比较。测定结果显示，本发明获得的突变酶的葡萄糖耐受浓度相对野生型BgllA提高了 13倍，而其他酶学性质如最适ρΗ、最适温度等没有发生变化，而其他酶学性质没有变化，在
4工业上具有应用价值，其可以改善木质纤维素的发酵工艺，并且可生产出高达20-30%浓度的果汁。
图1为本发明PCR扩增产物的电泳图谱；图1中1为PCR扩增的409S2片段，2为409S1片段，3为184S2片段，4为184S1 片段，M 为 DNA marker ο图2为本发明分别以409S1和409S2、184S1和184S2组合为模板PCR扩增产物的电泳图谱。图2中1为184S1和184S2组合为模板PCR扩增产物，2为409S1和409S2组合为模板PCR扩增产物，M为DNA marker ο图3为本发明纯化的突变蛋白和野生型蛋白的电泳图谱图3中1为H184F突变蛋白，2为L409E突变蛋白，3为野生型rBgllA，M为蛋白 markerο图4为本发明突变蛋白与野生型蛋白的葡萄糖耐受性能比较。图5为本发明突变蛋白与野生型蛋白部分酶学性质比较。其中图5A为最适pH比较，图5B为最适温度比较，图5C为pH稳定性比较，图5D 为温度稳定性比较。
具体实施例方式下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。(一 )、含有本发明β -葡萄糖苷酶突变基因的表达菌株的构建1、β -葡萄糖苷酶基因突变位点的选择以来自多粘芽孢杆菌(Paenikicillus polymyxa)的β-葡萄糖苷酶与葡萄糖复合物的结构作为模板，利用 Swiss-Model (http //swissmodel. expasy. otr/ ；Kiefer F, Arnold K, Kunzli Μ, Bordoli L, Schwede Τ. The SffIS S-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Research. 2009,37, D387-392.)建模海洋未培养微生物来源的葡萄糖苷酶(BgllA)，并通过叠加获得BgllA与葡萄糖复合物的结构。根据建模的结构信息，确定定点突变的位点为184位点的组氨酸H和409位点的亮氨酸L，突变方向为184位点的组氨酸H被苯丙氨酸F替代，409位点的亮氨酸L被谷氨酸E替代。2、突变引物的设计和突变基因的PCR扩增根据海洋未培养微生物来源的β -葡萄糖苷酶的基因序列SEQ ID No :2(其氨基酸序列如SEQ ID No 1),以及选定的突变位点184H和409L，设计以下6个定点突变引物以包含海洋未培养微生物来源的β -葡萄糖苷酶(BgllA)基因的重组质粒为模板质粒，将上述的合成突变引物进行配对，分别为bgllAS与184A、184S与bgllAA、bgllAS与 409A、409S与bgllAA，作为PCR引物对，扩增产物依次命名为184S1、184S2、409S1、409S2 ； 回收4中扩增片段，将184S1和184S2加入同一反应体系中，409S1和409S2加入另一反应体系中，作为各自反应体系中的PCR反应模板，并利用bgllAS、bgllAA引物对作为扩增引物，扩增bgllB突变基因全长序列并回收备用。
Oligo nucleotidesSequence(5'-3')184STGAAATGGGGGTGTTCGCGCCAGGTTTAMutation site underlined184ATTAAACCTGGCGCGAACACCCCCATTTCMutation site underlined409STGAGTGGGCAGAAGGTTATAGTAAGMutation site underlined409ACTTACTATAACCTTCTGCCCACTCAMutation site underlinedbgllASGGGCATATGACAAAATTAACTTTACCTNde I site underlinedbgllAATTTCTCGAGTTCGTGGGTAACAAGTGXho I site underlined3、表达载体的构建将步骤2中得到PCR扩增产物，与pMD18-T质粒连接(TaKaRa)，建立如下酶切体系25ng pMD18-T 载体，50ng PCR 扩增产物，5ul ligation mix，补水至 10ul，16°C连接 lh。连接产物热激转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，得到的转化子，测序验证是否突变；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有本发明β -葡萄糖苷酶突变基因的PMD18-T重组质粒；用Nde I和Bio I双酶切所得的pMD18-T重组质粒和ρΕΤ2^ (+)载体，然后用T4DNA 连接酶将酶切后的突变基因与表达质粒载体连接，建立如下酶切体系25ng pET22b(+)载体，50ng 突变基因酶切片段，3ul IOXligation buffer, Iul T4DNA 连接酶(TaKaRa)，补水至30ul，16°C连接8h，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，得到的转化子测序验证是否突变，挑选序列正确的转化子得到含有本发明突变基因的工程菌株E. coli BL2KDE3)/ pET22b(+)-bgllA/H184 禾口 E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A/L409E 本发明的菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b(+)-bgllA/H184F Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgllA/H184F 已送往中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)保藏，保藏单位地址中国 武汉 武汉大学；菌株保藏编号为CCTCC NO =M 2010159，保藏日期2010年6月25日。( 二 )、含本发明β -葡萄糖苷酶突变基因工程菌的表达与蛋白纯化将(一)中获得的基因的工程菌株Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) -bgl 1A/H184F 和 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) -bgl 1A/L409E 接种于含有氨苄青霉素的 200ml LB 液体培养基中，放置于37 °C、250rpm条件下培养至OD6tltl = 0. 6 (UNIC0 UV2102紫外可见分光光度计，以培养LB培养基为空白)；加入终浓度为0. 75mM的IPTG进行诱导，并于30°C、 180rpm条件下继续培养5小时；4°C、8000g离心收集菌体，加入0. 1倍菌液体积的Binding buffer, 350W冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗酶液。全菌蛋白SDS-PAGE显示蛋白表达量占全菌蛋白的50%以上。粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化。洗脱液中咪唑浓度为60mM，洗脱10个柱体积。得到的蛋白经过检测达到SDS-PAGE纯度。以pNPG为底物，纯化的β-葡萄糖苷酶突变蛋白的最适pH为6. 5，酶在pH5. 5-7. 5 范围内能够显示80%以上的酶活力。酶在pH6. 0-9. 0范围内有较高的稳定性，30°C条件下
6保温Ih仍然能够维持原酶活力的60%以上。突变蛋白在15°C _55°C范围内均能显示催化活性，其最适温度为40°C。 相对野生型葡萄糖苷酶蛋白，获得的突变蛋白的葡萄糖耐受浓度提高了 13 倍，葡萄糖对bgllA/H184E抑制的Ki为400mM(图4)，而其他酶学性质没有变化，在工业上具有应用价值。
权利要求
1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于所述突变体的氨基酸序列如以下任意一项所述 A)、SEQID No. 1所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第184位的组氨酸突变为苯丙氨酸；B)、SEQID No. 1所示的所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第409位的亮氨酸突变为谷氨酸。C)、SEQID No. 1所示的β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第184位的组氨酸突变为苯丙氨酸，第409位的亮氨酸突变为谷氨酸。
2.编码如权利要求1所述的一种β-葡萄糖苷酶突变体的DNA序列。
3.一种突变质粒，其特征在于，含有编码权利要求2所述的葡萄糖苷酶突变体的 DNA序列。
4.一种具有葡萄糖苷酶合成性能的工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的突变质粒。
5.一种葡萄糖苷酶，其特征在于，由权利要求3所述的工程菌发酵获得。
全文摘要
本发明通过基因定点突变的方法获得葡萄糖耐受浓度提高的β-葡萄糖苷酶的基因、突变质粒、工程菌，并可在将工程菌诱导表达后，获得葡萄糖耐受浓度提高的β-葡萄糖苷酶。本发明以来自海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶为基础，通过PCR定点突变，获得突变基因。相对野生型β-葡萄糖苷酶蛋白，获得的突变蛋白的葡萄糖耐受浓度提高了13倍，而其他酶学性质没有变化，在工业上具有应用价值，其可以改善木质纤维素的发酵工艺，并且可生产出高达20-30％浓度的果汁。
文档编号C12N1/19GK102220302SQ20111013252
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月20日 优先权日2011年5月20日
发明者刘娟娟, 张学成, 房伟, 方泽民, 洪宇植, 肖亚中 申请人:安徽大学