专利名称：实时动态高通量筛选治疗肾脏病药物的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选药物的方法，尤其涉及实时动态高通量筛选细胞粘附性下降引起细胞脱落的肾脏疾病治疗药物的方法。
背景技术：
药物的应用是十分复杂的研究，提高药物的准确应用在医药研究中具有重要意义。药物筛选是指对投入应用的药物需要筛选并对药物价值的评价，筛选的样品越多，发现针对性强、合适的药物的可能性越大，因此高通量药物筛选技术成为目前药物筛选的重要
Tno高通量筛选技术(High-throughput Screening, HTS)是20世纪80年代后期形成的寻找药物的高新技术，是应用先进的分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化控制等 高新技术，建立的一套更适合于药物筛选的技术系统。高通量筛选技术以分子和细胞水平的实验方法为基础，以微孔板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以计算机对实验获得的数据进行分析外理，在同一时间内可以对数以万计的样品进行快速检测。高通量药物筛选采用的筛选模型是体外微量实验方法，主要是分子和细胞水平的评价方法，而不是传统的动物实验或组织器官实验方法，这种微量实验方法减少了样品试剂材料的消耗，减低了筛选成本，但需要检测方法具有较高的特异性和灵敏性。尤其对于中药来讲，虽然具有毒副作用小等优势，但是中药种类繁多，而且对其功能研究不够充分，因此如何在众多中草药中选择出合适的药物并不容易，因此找出一种能够快速筛选药物的方法不仅对疾病的治疗非常关键，同时也对中药开发和利用也有着重要的意义。
发明内容
本发明提供了实时动态高通量筛选肾脏病治疗药物的方法，所述筛选药物的方法采用xCELLigence系统的技术建立基于细胞粘附的实时动态高通量药物筛选方法，在细胞水平筛选增加细胞粘附的化合物，本发明能够动态检测细胞粘附，实时观测细胞生长，从而还能监测药物效应起始时间点与最大作用时间点。本发明提供的实时动态高通量筛选治疗肾脏病药物的方法，包括以下步骤
步骤1，建立病理细胞模型，并加入待筛选药物；
步骤2，采用xCELLigence系统对加入待筛选药物后的细胞的粘附性进行实时动态监
测；
步骤3，筛选出能够增加细胞粘附性的药物。上述筛选药物的方法，其中，所述待筛选药物包括合成药物、天然药物以及中药单体。根据本发明筛选药物方法的一种优选实施方式，在步骤I中，所述病理细胞模型为足细胞系高糖刺激病理细胞模型，筛选出能够增加足细胞粘附性的药物，即抗糖尿病肾病药物。进一步地，步骤I中还设有正常糖对照组及高渗对照组。其中，所述高糖刺激病理细胞模型中含有D-葡萄糖30mmol/L;所述高渗对照组中含有甘露醇2Smmol /I,和D-葡萄糖5mmol/L。根据本发明筛选药物的另一些优选实施方式，在步骤I中，所述病理细胞模型为HK-2细胞缺氧/再复氧损伤模型，筛选出能够增加HK-2细胞粘附性的药物，即治疗缺血再灌注急性肾损伤药物。 上述筛选药物的方法，其中，在步骤2中，所述病理细胞模型置于96孔板上，平均细胞密度为3 X IO4个/孔。上述筛选药物的方法，其中，在步骤2中，所述实时动态监测为 每6分钟监测一次细胞粘附性。上述筛选药物的方法中，步骤2中所述实施动态检测还包半数有效浓度的计算，以及药物效应起始时间点、最佳作用时间、药物最佳剂量、有效剂量的检测。其中，所述最佳作用时间指的是足细胞粘附性增至最大时的时间，最佳剂量指的是能够增加足细胞粘附性的最小毒性剂量。本发明实时动态高通量筛选抗病药物的方法，优点在于
I)本发明筛选药物的方法无需标记和破坏细胞，因此不需要费力且成本高的细胞标记及细胞裂解或固定。2)本发明筛选药物的方法可实时观测足细胞生长、药物效应起始时间点与最大作用时间点，并提供不同时刻足细胞粘附半数有效浓度(EC50)，实现实时动态、准确高效筛选增加足细胞粘附的化合物，改变了传统细胞分析只能仅仅提供最终结果的终端形式。3)本发明筛选药物的方法，能够在细胞水平实时大通量对药物进行筛选。4)本发明筛选药物的方法，经动物实验和V因子分析证明具有稳定性和可靠性。因此，本发明实时动态高通量筛选治疗肾脏病药物的方法具有无损伤、实时动态检测、信息量大。而且过程简洁、重复性好的特点。
图I为采用本发明方法筛选所得药物黄芪甲苷减轻足细胞脱落的治疗效果；
图2为采用本发明方法筛选所得药物黄芪甲苷降低尿白蛋白的治疗效果。
具体实施例方式本发明所公开的是一种实时动态高通量筛选治疗肾脏病药物的方法，通过采用xCELLigence系统的技术建立基于足细胞粘附的实时动态高通量药物筛选方法，在细胞水平初筛增加足细胞粘附的化合物，动态检测足细胞粘附，实时观测细胞生长、药物效应起始时间点与最大作用时间点。所述xCELLigence系统采用罗氏与ACEA Biosciences公司联合开发的细胞分析仪，可追踪细胞变化与细胞粘附情况。本发明实时动态高通量筛选治疗肾脏病药物的方法的操作步骤如下
步骤1，建立病理细胞模型，并加入待筛选药物；
步骤2，采用xCELLigence系统对加入待筛选药物后的细胞的粘附性进行实时动态监测；
步骤3，筛选出能够增加细胞粘附性的药物。上述筛选药物的方法，其中，所述待筛选药物包括合成药物、天然药物以及中药单体。下面通过具体实施例对本发明筛选药物方法进行详细介绍和说明，以使更好的理解本发明，但下述实施例并不限制本发明范围。实施例I
足细胞粘附力下降，导致足细胞从肾小球基底膜脱落是早期糖尿病肾病进展的关键， 增加足细胞粘附对防治早期糖尿病肾病具有重要价值，本发明可通过实时动态检测足细胞粘附以筛选能够增加足细胞粘附性、从而抗早期糖尿病肾病的药物。步骤1，建立足细胞系高糖刺激病理细胞模型，并加入待筛选药物
培养瓶预先经0. lmg/ml胶原I在37°C处理I小时，足细胞生长在含10U/ml y -干扰素、10%胎牛血清、100U/ml青链霉素、lOOPg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，在5%C02、33°C培养孵箱传代培养。然后转入37°C、含5%C02培养孵箱分化，备用。生长状态良好的足细胞种植于经胶原I处理的培养板中，然后建立高糖(30 mmol/L D-葡萄糖)刺激下的足细胞病理模型，同时设立正常糖对照组(5 mmol /L D-葡萄糖)及高渗对照组(25 mmol/L甘露醇+ 5 mmol /L D-葡萄糖)，备用。采用xCELLigence系统实时动态筛选增加足细胞粘附药物
采用基底膜复合物(BMC)模拟人体肾小球基底膜(GBM)成分，将生长状态良好且已分化的足细胞种植于铺有BMC的培养板中。BMC是从小鼠组织中提取的一种可溶性基底膜蛋白复合物，主要成分为层粘连蛋白，IV型胶原及硫酸肝素蛋白聚糖，它与人体GBM的成分基本类似，为研究足细胞粘附功能提供了模拟人体内的生理环境。步骤2，采用xCELLigence系统对加入待筛选药物后的足细胞的粘附性进行实时动态监测；
将Iy g/ml BMC铺于96孔板在4°C过夜，用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗，加入各实验组足细胞，平均细胞密度为3 X IO4个/孔，然后加入不同中草药化合物，采用xCELLigence系统检测足细胞粘附，该系统可以每6分钟一次实时动态监测足细胞粘附，还可最后计算半数有效浓度(EC50)
步骤3，利用该系统实时动态、准确高效筛选增加足细胞粘附的化合物。所筛选出的药物即为抗早期糖尿病肾病的药物。实施例2
肾缺血或肾毒性引起肾小管损伤中，主要表现为近端小管刷状缘脱落、细胞肿胀和空泡变性等。近端肾小管上皮细胞(PEC)从基底膜上脱落，使肾小管基膜上出现缺损/剥脱区，且脱落的PEC多数形态完整并有存活能力，说明急性肾小管坏死时有活的PEC脱落。研究表明细胞粘附力改变可导致PEC从基底膜上脱落，整合素能介导细胞与细胞和细胞与基质的粘附，并维持肾小管结构的完整性。缺血再灌注损伤可引起近端肾小管上皮细胞(PEC)粘附力下降，导致PEC从肾小管基底膜脱落，导致肾小管阻塞，这是急性肾损伤/急性肾功能衰竭的重要机制，因此，增加PEC粘附，将从根本上防止PEC脱落和增强修复，维护上皮系统功能的完整性，减轻病理损伤。
近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)缺氧/再复氧损伤模型的建立HK_2细胞生长于含D-葡萄糖5mmol/L、体积分数为0. I的胎牛血清的1640-RPMI培养基中，贴壁细胞融合铺满瓶底后，消化细胞，并将细胞悬浮，按I X IO8接种到培养瓶中继续传代，传代培养2 4代用于实验；HK-2细胞置于氧气浓度为1%、二氧化碳浓度为5%的培养箱中，造成缺氧；缺氧后将细胞放置正常培养箱中，造成缺氧/再复氧损伤细胞模型。按照实施例I所述方法检测HK-2细胞粘附性，并筛选出能够增加HK-2细胞粘附性的药物，所筛选的药物即为抗缺血再灌注急性肾损伤药物。筛选条件的优化本发明筛选药物的方法还可实施检测药物效应起始时间点与最大作用时间点，药物最佳作用浓度及最小毒性剂量选择等。筛选方法的评估系统经过优化后，为了确认筛选系统是否符合高通量筛选的要求，采用V因子分析法来进行评估高通量筛选系统的稳定性和可靠性，其计算公式如下
权利要求
1.一种实时动态高通量筛选肾脏病治疗药物的方法，其特征在于，所述的筛选药物的方法包括以下步骤 步骤1，建立病理细胞模型，并加入待筛选药物； 步骤2，采用xCELLigence系统对加入待筛选药物后的细胞的粘附性进行实时动态监测； 步骤3，筛选出能够增加细胞粘附性的药物。
2.根据权利要求I所述的筛选药物的方法，其特征在于，所述待筛选药物包括天然药物以及中药单体。
3.根据权利要求I所述的筛选药物的方法，其特征在于，在步骤I中，所述病理细胞模型为足细胞系高糖刺激病理细胞模型。
4.根据权利要求3所述的筛选药物的方法，其特征在于，所述高糖刺激病理细胞模型中含有D-葡萄糖30mmol/L。
5.根据权利要求3所述的筛选药物的方法，其特征在于，步骤I中还设有正常糖对照组及高渗对照组。
6.根据权利要求5所述的筛选药物的方法，其特征在于，所述高渗对照组中含有甘露醇 2Smmol /I,和 D-葡萄糖 5mmol/L。
7.根据权利要求I所述的筛选药物的方法，其特征在于，在步骤I中，所述病理细胞模型为HK-2细胞缺氧/再复氧损伤模型。
8.根据权利要求I所述的筛选药物的方法，其特征在于，在步骤2中，所述病理细胞模型置于96孔板上，平均细胞密度为3 X IO4个/孔。
9.根据权利要求I所述的筛选药物的方法，其特征在于，在步骤2中，所述实时动态监测为每6分钟监测一次细胞粘附性。
全文摘要
本发明提供一种实时动态高通量筛选治疗肾脏病药物的方法，在铺有基底膜复合物的种植细胞的培养板上，加入不同的中草药待筛选药物；通过xCELLigence系统对细胞粘附进行实时监测和定量评估；筛选能够增加细胞粘附的化合物。所述实时动态高通量筛选治疗肾脏病药物的方法具有无损伤、实时动态检测、信息量大且过程简单、快速、重复性好的特点。
文档编号C12Q1/02GK102796799SQ201110132629
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月23日 优先权日2011年5月23日
发明者汪年松, 桂定坤, 王筱霞, 王 锋, 范瑛 申请人:上海市第六人民医院