一种抗MRSA群体感应agr系统反义脱氧核酶的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种反义抗菌脱氧核酶——DNAzyme23。本发明的反义抗菌脱氧核酶以金黄色葡萄球菌群体感应agr系统效应分子RNAIII为靶点，不影响细菌生长状态，能够有效阻断agr信号通路、显著减弱细菌毒力，尤其可以显著减弱耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的致病力。具有高特异性、低毒、安全、不易诱导细菌耐药性的增加等优点。
【专利说明】-种抗MRSA群体感应agr系统反义脱氧核酶的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及一种抑制MRSA群体感应agr系统的反义抗 菌脱氧核酶及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌与多种人类感染性疾病密切相关，如皮肤感染、呼吸道感染、甚至 包括威胁生命的坏死性肌膜炎、坏死性肺炎等。目前治疗MRSA最有效的药物是万古霉素， 然而随着耐万古霉素 MRSA的出现，人们即将面临无药可用的境地，因此寻找新的特异性抗 MRSA感染的新靶点及新策略成为细菌感染治疗领域的研究热点和难点。
[0003] 人类滥用抗生素是导致细菌发生耐药的最主要原因之一，在持续的抗生素选择性 压力作用下，细菌耐药是一个必然发生的事件，每一种新的抗生素一经问世，很快便会产生 耐药。探索和研制不易诱导细菌产生耐药的抗菌新策略和新药物是当今世界各国科学家必 须面对的紧迫研究课题。群体感应系统是广泛存在于细菌内的一种群体行为调控机制，它 不仅控制细菌间的信息交流和细菌的多种生命活动，而且也是致病菌生物被膜形成、毒力 因子释放、致病力大小，以及耐药性发生的重要调控系统。
[0004] agr是金黄色葡萄球菌主要的群体感应系统，控制着许多毒力基因的表达，与细 菌的致病力密切相关。agr是一个双组份信号系统，由AgrA，AgrB，AgrC，AgrD及效应分子 RNAIII构成。RNAIII是一个具有复杂二级结构的调节性RNA，在不同的葡萄球菌中RNAIII 的结构高度保守。RNAIII-方面编码26个氨基酸的δ-溶血素，另一方面能够调节个别胞 外蛋白和多功能调节子的转录。
[0005] 反义抗菌剂突破以细菌蛋白为靶点的经典研究思路，以细菌体内致病、耐药、群体 感应等相关基因为祀点，从阻断相关基因的表达入手，进而达到抑制或杀灭细菌的作用，为 抗耐药菌治疗带来了新的希望。与经典的抗生素相比较，反义抗菌剂具备以下突出的优点： 一、以细菌基因为靶点，特异性高；二、靶点明确，研发成本低，只需知道基因序列就可得到 相应的反义药物；三、生产成本低，用常规的寡核苷酸合成技术就能合成。因而反义抗菌剂 被认为是抗耐药菌感染最有希望的突破口，代表着21世纪分子治疗领域革命性的进展。
[0006] 10-23型脱氧核酶能在RNA的A-U位点切割，可切割任何mRNA的起始密码AUG，从 而调控蛋白质的表达。10-23型脱氧核酶是一种潜在的强有力的RNA特异性切割工具，在体 外可应用于RNA限制性内切酶，在生物系统内，可在RNA水平上阻断靶基因表达。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于通过对MRSA群体感应agr系统效应分子RNAIII mRNA为靶点 进行研究，提供一种反义脱氧核酶抗金黄色葡萄球菌agr系统的应用。
[0008] 本发明的目的是这样实现的：
[0009] 一种反义抗菌脱氧核酶 DNAzyme23,序列为 5' -TTAAACAACTCAGGCTAGCTACAACGACA A-3'，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为 鸟嘌呤核苷酸单体；下划线所示序列为10-23型脱氧核酶的催化核心；所有核苷酸均进行 硫代修饰。
[0010] 本发明通过试验研究DNAzyme23对MRSA菌株（LAC)群体感应agr系统效应分子 RNAIII的影响，结果显示DNAzyme23能浓度依赖性地抑制靶基因 RNA III的表达、显著降低 a -toxin的分泌。另外，功能学实验表明，DNAzyme23处理组的细菌培养上清对兔红细胞的 裂解，与对照组相比明显降低。根据这些试验结果，本发明提供了上述反义抗菌脱氧核酶在 制备抗耐药菌的药物中的应用。优选所述的耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
[0011] 本发明所涉及的反义抗菌脱氧核酶具有如下优点和显著的进步：以金黄色葡萄球 菌agr群体感应系统RNAIII效应分子为靶点，具有高特异性、低毒、安全、不易诱导细菌耐 药性的增加等优点。能够有效阻断agr信号通路、并减弱细菌毒力。具体表现在=RT-PCR法 检测发现，DNAzyme23能剂量依赖性地抑制LAC菌株RNAIII基因的表达；Western blot显 示DNAzyme23能够显著降低a -toxin的分泌。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图 IDNAzyme 对 RNAIII 表达变化的影响柱状图；林*P〈0. OOlvs. control。
[0013] 图 2DNAzyme23 对 a-toxin 表达的影响柱状图；*Ρ〈0· 05vs. control ; 林Ρ〈0· Olvs. control ;***Ρ〈0· OOlvs. control。
[0014] 图 3DNAzyme23 对溶血素分泌的影响柱状图；*P〈0. 05vs. control ;***P〈0. OOlvs. control〇
【具体实施方式】
[0015] 本发明以金黄色葡萄球菌agr群体感应系统效应分子RNAIII为靶点，设计并合成 特异性祀向RNAIII mRNA的脱氧核酶（deoxyribozyme, DNAzyme),通过细菌最小抑菌浓度 测定、RNAIII和a -toxin表达水平及溶血素分泌实验，探讨脱氧核酶抑制金黄色葡萄球菌 感染的效果，并最终筛选出效果显著的DNAzyme23,其可制备成为特异性降低MRSA致病力 的新型药物--反义抗菌剂，为MRSA感染的防治寻找出了新的突破口。
[0016] 以下是本发明涉及的DNAzyme的筛选实施例及DNAzyme23的效果试验例。
[0017] 实施例1设计、合成并筛选抗金葡菌RNAIII mRNA的DNAzyme
[0018] ⑴筛选RNAIII mRNA的有效靶点，设计特异高效的DNAzyme :采用RNA Structured 5软件详细分析RNAIII mRNA的序列并预测其二级结构，以30个碱基 为DNAzyme基本长度，在非保守序列区、非折叠区选择有效靶点，筛选出最优的7条 DNAzyme (见表 1)。
[0019] 表1针对RNAIII mRNA设计的脱氧核酶（DNAzyme)
[0020]
【权利要求】
1. 一种反义抗菌脱氧核酶 DNAzyme23,序列为 5' -TTAAACAACTCAGGCTAGCTACAACGACAA-3'，其中A为腺嘌呤核苷酸单体，T为胸腺嘧啶核苷酸单体，C为胞嘧啶核苷酸单体，G为鸟 嘌呤核苷酸单体；下划线所示序列为10-23型脱氧核酶的催化核心；所有核苷酸均进行硫 代修饰。
2. 根据权利要求1所述反义抗菌脱氧核酶，其特征在于：核苷酸单体中的碱基为鸟嘌 呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶。
3. 权利要求1所述反义抗菌脱氧核酶在制备抗耐药菌的药物中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌。
【文档编号】A61P31/04GK104293790SQ201410545851
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】侯征, 罗晓星, 薛小燕, 李明凯, 周颖, 孟静茹, 达飞 申请人:中国人民解放军第四军医大学