宫膜干细胞的规模化生产工艺的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种宫膜干细胞规模化生产工艺，包括：（1）宫膜干细胞的分离提取和原代培养；（2）宫膜干细胞的培养扩增：（3）宫膜干细胞的大规模培养：（4）宫膜干细胞的检测；（5）宫膜干细胞的冷冻保存；（6）长期冷冻保存，定期进行复苏检测。本发明由育龄期妇女的月经血中获得宫膜干细胞，利用体外培养扩增方法，短期内获得较多数量富有功能活性的高质量宫膜干细胞，经检测合格后，长期冷冻保存在-196℃的环境中，为未来的临床以及科研提供大量的宫膜干细胞资源，具有极大的社会价值和意义。
【专利说明】宫膜干细胞的规模化生产工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学工程领域，涉及干细胞的培养扩增及长期保存方法，尤其涉及一种宫膜干细胞的规模化生产工艺。
技术背景
[0002]众所周知，干细胞技术是当今生命科学中最热门的技术之一，其研究内容几乎涉及所有生物医学领域，除了在细胞治疗、组织/器官移植和基因治疗中发挥重要作用外，在发育生物学和新药开发等方面也产生重要影响。近几年来干细胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最权威的美国《science》杂志连续2年将干细胞和人类基因组计划列为当年的十大科学突破，尤其是在1999年甚至将干细胞研究列于第一位。干细胞具有不可估量的医学价值，引起全世界的广泛关注和研究。
[0003]相较于骨髓干细胞的难以获得以及胚胎干细胞的伦理问题、致畸性，子宫内膜干细胞因其来源的广泛，更强的自我更新和增殖能力，无伦理问题等优势正在获得越来越多的关注。研究证实，女性脱落的子宫内膜组织中分离得到的宫内膜干细胞数量为骨髓来源的30倍，增殖能力为普通其他干细胞的100倍，分化潜能也接近胚胎干细胞。同时宫膜干细胞取自女性废弃的月经中，将这些干细胞通过科学的方法储存起来可实现变废为宝。在女性及其家人未来的生命中，发生重大疾病或意外严重伤害时，利用事先储存起来的干细胞去恢复健康甚至挽救生命都是有可能的。
[0004]利用宫膜干细胞有望治疗包括糖尿病、帕金森症、退行性细胞或组织疾病等多种疾病，然而一次成功的治疗需要约IO9个细胞，这意味着分离出的干细胞必须在短时间内经过有效的体外扩增，获得大量高质量的干细胞，方能达到细胞治疗的要求。传统的二维平面扩增宫膜干细胞较难在短 时间内得到足够的细胞量，且经多次传代造成干细胞质量下降，而转瓶和生物反应器培养可以获得足够多的细胞数目用于干细胞治疗。
[0005]传统的贴壁依赖性细胞的培养采用静止或者转瓶等培养方法，操作复杂，耗费空间及人力。1967年，Van Wezel首次提出了“微载体系统”的概念，为贴壁依赖性细胞的高密度培养提供了思路，并创建了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。微载体是指由交联葡聚糖或者其他聚合物组成微珠，直径一般在60-200 μ m之间，适用于贴壁依赖性细胞的生长。使用此类小球为细胞提供贴附面积，通过轻轻搅拌使载体悬浮于培养液中，细胞也成为了悬浮状态，这种培养方式被称为微载体培养技术。
[0006]由于微载体本身所占体积和质量不大，但有很大的有效面积可供细胞附着，大大提高了生产效率。比如5mg Cytodex I表面积能达到30cm2/mL,而传统的单层培养难以达到如此高的表面积/容积比。IL微载体培养生产的细胞相当于50个转瓶所生产的细胞。这种培养方式对劳动力的需求也下降了许多:省却了玻璃容器等的清洗和准备工作；细胞与培养液的分离简单，一旦搅拌停止，3分钟后细胞即能依靠其重力而沉降，无需进行离心操作，减少了复杂的操作步骤。而且，细胞生理活性培养参数等容易控制，污染概率也大大降低。[0007]动物细胞体外大规模培养主要包括分批培养、灌注培养和补料分批培养模式。
[0008]分批培养模式，其特征在于将牙髓干细胞和培养液一次性装入生物反应器内进行培养，细胞不断生长，得到大量扩增，经过一段时间之后，将这个反应系统取出，消化得到高质量的牙髓干细胞。
[0009]连续灌注式生物反应器是在细胞培养生物反应器系统中安装细胞微载体截留装置，将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养。一方面新鲜培养液不断加入反应器内；另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。连续灌注式生物反应器可以对细胞的微环境进行更为精确的监测和控制，既省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，培养细胞的密度及质量可以得到很大提高。
[0010]补料分批培养是介于分批培养和连续培养之间的培养方法。在细胞培养过程中，随着营养物质消耗，间歇或连续地添加营养成分或新鲜培养基，但不同时收获培养液。
[0011]干细胞临床治疗需要大量高活性的干细胞，所以如何在体外短期内培养足够数量的高质量的治疗用细胞以及提供一个规模化、标准化、系统化的细胞储存系统成为了学术界和产业界密切关注的焦点。
[0012]本发明针对现有作为种子细胞的宫膜干细胞的快速获取、扩增与长期保存困难等问题，目的在于寻找一种更为高效的培养扩增及长期保存方法，使宫膜干细胞的制备达到规模化的程度。
[0013]发明概述
[0014]本发明公开了一种宫膜干细胞规模化生产工艺方法。
[0015]本发明提供的宫膜干细胞规模化生产工艺方法包括以下步骤: [0016](I)宫膜干细胞的分离提取:月经血经密度梯度离心后，在含胎牛血清细胞培养液的培养器皿中，在37°C、5%C02条件下进行原代培养；
[0017](2)宫膜干细胞的培养扩增:将步骤(1)获得的原代细胞以0.5X IO6-L 5X IO6个细胞/cm2的密度接种于二维培养器皿中，加入新鲜细胞培养液，于37°C、5%C02条件下培养，3天换液；
[0018](3)宫膜干细胞的大规模培养:将步骤(2)获得的宫膜干细胞接种在转瓶或生物反应器中，调整溶解氧浓度、PH值、搅拌转速和通气量，根据取样分析细胞计数、存活率、营养成分和代谢物的结果更换培养基，从而达到细胞的高密度大规模培养；
[0019](4)宫膜干细胞的检测:进行干细胞特性、无菌性、支原体、衣原体检测；
[0020](5)宫膜干细胞的冷冻保存:将检测合格的细胞冻存于管内，细胞的详细信息扫描入数据管理系统，自动化系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中；
[0021](6)根据需要，进行长期冷冻保存，并定期从冻存环境中取出细胞进行复苏检测。
[0022]步骤(1)中，经血取自例假第二天，与无菌PBS混合均匀后于0-10°C运送至实验室。用淋巴细胞分离液采用密度梯度离心的方法获得单核细胞，无菌PBS冲洗3-4次，完全培养液(a -MEM+双抗+两性霉素+20%胎牛血清)吹打悬起，转移至6孔板中，与37°C、5%C02培养箱内进行原代培养。
[0023]步骤(2)中，将步骤(1)培养的原代细胞(在长满培养器皿底部80%_90%时)用胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱离原代培养器皿后接种于二维培养器皿，所述二维培养器皿选自细胞培养孔板、培养皿、T瓶等二维培养方式。
[0024]步骤(3)中，调节溶解氧浓度为40%-60%、pH值为6.8-7.2、搅拌转速为80_120rpm。
[0025]步骤(3)中所述的转瓶培养按以下过程进行:将微载体经预处理、转瓶硅化、121°C高温灭菌后，接种细胞，微载体加入量为3-20g/L，微载体的大小范围为60-300μπι，接种密度为2Χ105-6Χ105个细胞/ml，转瓶的大小范围为25ml-500ml，转速范围50-75rpm/min,培养方式是分批培养。
[0026]步骤(3)中所述的生物反应器选自细胞培养生物反应器，包括搅拌式生物反应器、固定床生物反应器和WAVE生物反应器。
[0027]本发明的生产工艺中，微载体生物反应器按以下过程进行细胞培养:将微载体用PBS冲洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱内平衡水化过夜，高压蒸汽灭菌后，接种宫膜干细胞，微载体的加入量为3-20g/L，接种密度为IO5-1O6个细胞/mL，细胞扩增至密度为5X 106-5X 107 个细胞/mL。
[0028]本发明的生产工艺中，步骤(5)中输入的细胞详细信息包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期；所述冷冻保存包括将所获得的宫膜干细胞按I X IO7IX IO7个/ml细胞密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，经过程序降温后，将冻存管转移至_196°C液氮中冷冻保存，所述冻存液组分及体积比为DMSO:胎牛血清:a -MEM培养液(1:2:7)。
[0029]发明详述
[0030]本发明针对现有作为种子细胞的宫膜干细胞的快速获取、扩增与长期保存难等问题，寻找一种适用于规模化生产的宫膜干细胞高效培养扩增及长期保存方法。
[0031 ] 下面详细描述本发明的宫膜干细胞规模化生产工艺。
[0032]一、宫膜干细胞的分离提取
[0033]①准备含有青霉素、链霉素和两性霉素的PBS或Hanks液4_10mL作为保存液?’②将取自月经第二天的月经血倒入保存液中，低温环境(0_8°C )转移到实验室处理；③准备5-10mL淋巴细胞分离液，将等体积的样品缓慢加到分离液上层，密度梯度离心，300-500g，20-40分钟(加速度和减速度均设为1，温度为10-30°C 离心结束后移去上清，小心取中间白膜层至另一洁净离心管中，加3-5mLPBS或Hanks液吹打,冲洗，1000-1500rmp离心5-10分钟，重复2-3次除菌；⑤获得的单核细胞用ImL左右完全培养液(a -MEM+双抗+两性霉素+20%胎牛血清)吹打悬起；⑥细胞悬液接种至六孔板中，补加培养液至3mL，放入37 °C、5%C02培养箱中培养。
[0034]二、宫膜干细胞的培养扩增
[0035]当原代细胞长满器皿底80~90%时，用胰酶+0.05%EDTA消化并吹打细胞，使细胞完全脱离后，接种到二维培养器皿中，加入细胞培养液，在恒温培养箱中培养扩增。
[0036]当采用二维培养器皿进行宫膜干细胞培养扩增时，根据培养容器的底部表面积及原代细胞的数量，将原代细胞以0.5 X IO6-L 5 X IO6个细胞/cm2的密度接种于二维培养器皿中，加入a -MEM细胞培养液于37°C、5%C02条件下培养，3天换液。
[0037]二维培养器皿常见的有各种细胞培养孔板，培养皿、T瓶等。
[0038]三、宫膜干细胞的大规模培养
[0039]采用转瓶培养或生物反应器进行宫膜干细胞的大规模培养，在培养过程中，应调整溶解氧浓度、pH值、搅拌转速和通气量，根据取样分析细胞计数、存活率、营养成分和代谢物的结果更换培养基，从而达到细胞的高密度大规模培养。
[0040]反应器培养的一个主要问题就是溶氧限制，培养基中的氧气的溶解度很低(7.6 μ g/ml)，典型密度2X 106/ml培养的细胞在不到Ih的时间内就会耗尽培养基中的氧气，因此必须在培养周期内不断向培养基中通入氧气。通过控制空气、氮气、二氧化碳、氧气的比例维持培养液中的溶解氧在一个合适的水平供细胞消耗。培养过程中通过搅拌一方面使细胞悬浮于培养基中，另一方面可以促进液体混合传质，提高供氧能力。细胞代谢的副产物积累会影响培养液的PH值从而影响到细胞生长，所以需要通过分析培养基成分控制添加新鲜培养基的速率，以提供给细胞一个良好的营养环境。
[0041]转瓶培养扩增的过程包括:将微载体经预处理、转瓶硅化、121 °C高温灭菌后，接种细胞，微载体加入量为3-20g/L，微载体的大小范围为60-300 μ m，接种密度为2 X 105-6 X IO5个细胞/ml，转瓶的大小范围为25ml_500ml，转速范围50_75rpm/min，培养方式是分批培养。
[0042]生物反应器培养扩增的过程包括:①微载体的预处理:将微载体用PBS冲洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱内平衡水化过夜，高压蒸汽灭菌；②将转瓶或大量二维平皿扩增培养的宫膜干细胞a -MEM细胞培养液制成细胞悬液，接种在微载体上，反应器的体积为3-10L，微载体的加入量为3-20g/L，接种密度为IO5-1O6个细胞/mL，细胞培养扩增至密度为5X 106-5X IO7个细胞/mL 用胰酶+0.0596EDTA收获所扩增的宫膜干细胞，进行后续检测。
[0043]上述微载体包括温度敏感性高分子材料，如聚N-异丙基丙烯酰胺，可以通过温度降低引起高分子材料相变，细胞脱落并保留大量表面标志物从而得到大量高质量高活性的细胞。
[0044]生物反应器培养扩增可以是一级生物反应器培养，也可以是多级培养。在一级生物反应器中细胞生长到 一定程度时，根据对细胞数量的要求可进行下一级细胞放大培养，即将微载体上的细胞完全消化之后作为种子细胞接种下一级生物反应器或者直接添加新的微载体进行球转球放大培养。
[0045]生物反应器可选自搅拌式生物反应器、微载体生物反应器、气升式生物反应器、固定床生物反应器、旋转壁式生物反应器、膜式生物反应器、间歇式或连续灌注式生物反应器、波浪式(wave)生物反应器、一次性生物反应器及细胞工厂等，以及其他各种形式和基于各种原理的细胞体外大规模培养系统或装置。
[0046]搅拌式生物反应器主要是通过搅拌器转动来搅动培养液以增加传质能力，确保细胞培养的氧浓度和营养物质的均一性，达到大规模培养细胞的目的，同时使培养液对细胞施加一定的剪应力。目前在医学组织工程研究中最常用的是搅拌瓶反应器。其主要特点是采用磁力转子搅动培养液，把干细胞接种在磁力搅拌的培养液中，细胞在持续搅动的培养液中生长。搅拌式生物反应器的最大优点是，能培养各种类型的动物细胞，培养工艺容易放大，产品质量稳定，非常适合于工厂化生产。
[0047]微载体反应器将悬浮培养和搅拌培养两种技术结合在一起，使球形微载体悬浮于搅拌的细胞培养液中，贴壁细胞在这些悬浮微球表面生长。由于微球有更大的表面积，因此物质转运得以加强，在悬浮微球表面贴壁生长的细胞亦会受到剪切应力的刺激。微载体反应器既能像悬浮培养那样获得大量细胞，又满足了哺乳动物细胞贴壁培养的要求，兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，同时又运用了搅拌培养技术，给细胞施加流体应力刺激，有利于细胞的增殖、分化。目前使用的微载体有商业化的Cytodex 1/3、Cultispher G/S、Biosilon, Hillex和HyQSp here，以及人工自制的纤维素、陶瓷、壳聚糖、胶原、明胶、PCL、PLA, PLGA等都可以应用于牙髓干细胞的培养扩增。
[0048]固定床生物反应器内部填充片状载体，使细胞贴服生长，通过连续灌注新鲜培养液使细胞达到较高密度，培养过程中，细胞营养充足，代谢废物能及时去除，为细胞生长提供一个良好的环境。使用的片状载体包括NBS公司的聚酯纤维等一切可以利于细胞贴服生长的材料。
[0049]旋转壁式生物反应器一般由水平放置的内、外同心圆筒组成，内筒由半透膜构成，外筒由非通透性的材料制成。培养液及培养物共处于两个同轴的内、外圆筒之间，根据具体要求确定圆筒的旋转方式。圆筒刚开始转速较慢，随着培养物体积的增大而动态地增加转速，使旋转产生的离心力刚好和细胞与微载体或支架复合物的重力平衡，无须固定支架即可使之悬浮于培养液中。因该系统无气泡或搅拌器，故几乎没有破坏性的剪切力，使得大细胞团得以形成，细胞表型表达更充分。旋转壁式生物反应器具有微重力环境、低剪切应力、高效的传质过程及零顶空间.即整个生物反应器系统被培养基充满等优点。
[0050]膜式生物反应器有一个起传质作用的透析性膜。它的主要优点是:①细胞或组织留在反应器内，反应器连续灌流；②使用膜包埋技术，这对于易受到剪应力破坏的细胞是有利的。膜式生物反应器中膜件的结构形式很多，有平板式、螺旋卷绕式、管式及中空纤维式等，其中中空纤维式应用最多，因为它的表面积较大，能生产高密度的细胞。
[0051]采用以上生物反应器进行细胞培养的模式包括分批培养模式、间歇式培养模式和连续灌注式培养模式。
[0052]分批培养模式是将压碎干细胞和培养液一次性装入生物反应器内进行培养，细胞不断生长、大量扩增，经过一段时间之后，将这个反应系统取出，消化得到高质量的牙髓干细胞。
[0053]间歇式培养模式采用间歇式生物反应器，在反应器中加入培养液，进行灭菌后，接入细胞株，在维持适合细胞生长和产物生成的条件下进行细胞培养，反应过程中除需要通入一定量的无菌空气、消泡剂和酸碱外，一般不再加入培养基和培养物，也不取出产物，只有等反应进行到一定程度后，才全部将培养液放出，进行后处理。
[0054]连续灌注式培养模式，在连续灌注式生物反应器系统中安装细胞微载体截留装置，将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养。一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。连续灌注式生物反应器可以对细胞的微环境进行更为精确的监测和控制，既省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，培养细胞的密度及质量可以得到很大提高。
[0055]一次性生物反应器是一次性使用的波浪袋生物反应器，用以替代传统的不锈钢发酵罐。一次性反应器适用于各种类型的细胞培养。温和的波浪式运动可以起到良好的供氧和混合的目的，同时，这种运动方式所产生的剪切力也很小，远远小于传统罐体中用搅拌或者气升式方法所产生的剪切力；能够支持高密度大规模细胞培养，并且不会形成泡沫和剪切力的破坏作用。
[0056]四、宫膜干细胞的检测[0057]在宫膜干细胞大规模培养过程中，需进行干细胞表面抗原检测，无菌性检测，支原体，衣原体检测等。所用的检测方法包括流式细胞检测、培养法检测、PCR检测等。
[0058]五、宫膜干细胞的冷冻保存
[0059]细胞收获之后，用培养液反复吹打细胞，混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行无菌检测、支原体检测、病毒检测、免疫表形检测、细胞技术和活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测，以确定其是否到达合格标准。经过检测符合标准的牙髓干细胞按IXIO7IxIO7个细胞/ml的密度在冻存液中重悬，分装入冻存管。
[0060]填写细胞的详细信息，包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期等，完整记录每一样本的真实冷冻状况，冻存管上的信息感应部位对准扫描枪，将信息准确无误地扫描入数据管理系统，完成细胞库信息录入和构建。
[0061]各冻存管经过程序降温后，转移至_196°C液氮中冷冻保存。系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中。
[0062]冻存空间应符合国家相关文件规定，具有良好的卫生环境，包括洁净区、通风、采光环境。
[0063]冻存期间定期从冻存环境中取出细胞进行检测。定期检测的内容包括细胞复苏、细胞活性检测等。
[0064]本发明提供的宫膜干细胞规模化生产工艺建立了宫膜干细胞大量扩增方法，并建立了宫膜干细胞的标准化、系统化冻存体系，建立了长期高质量储存宫膜干细胞的细胞库，以便为临床及科研提供足 够高质量的干细胞资源，成本低廉，应用前景广阔。
[0065]本发明的宫膜干细胞规模化生产工艺中尤其使用了生物反应器微载体培养技术大量培养干细胞。与传统的培养方法相比，本发明的方法具有以下优点:
[0066](I)微载体表面积/体积比大,单位体积培养细胞的产率高。较传统的单层细胞培养面积大大增加，可以在短期内大量得到牙髓干细胞；
[0067](2)微载体悬浮于培养基中，牙髓干细胞生长环境均一，简化了培养条件的监测和控制，同时培养基利用率高；
[0068](3)采样重演性好，细胞最终收获过程不复杂，劳动强度小，占用空间小，操作简便，所需人员少，工艺容易放大生产，可以保证细胞质量；
[0069](4)细胞培养系统符合最新的法规标准，安全性更好。
[0070]同时，本发明的宫膜干细胞规模化生产工艺中尤其采用了标准化、系统化的宫膜干细胞长期冻存方法。干细胞通过体外大规模扩增后，按照标准化流程冻存，冻存空间具有良好的卫生环境，包括洁净区，通风，采光环境，符合国家相关文件规定。同时，详细记录的细胞信息以备未来科研和临床使用。
[0071]本发明的宫膜干细胞规模化生产工艺不仅能大大增加宫膜干细胞作为种子细胞的数量，而且能够长期保持其生长与分化的能力，冷冻复苏后也能够保持其干细胞的基本特性，经过冷冻保存后能够为未来的临床以及科研提供大量的宫膜干细胞资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0072]图1是本发明宫膜干细胞规模化生产工艺的流程图。【具体实施方式】
[0073]实施例1.宫膜干细胞的分离提取
[0074]宫膜干细胞的分离提取包括以下步骤:
[0075]1.准备保存液
[0076]15mL离心管内加入5_10mL无菌PBS,添加两性霉素1_4 μ g/mL,青霉素80-100 μ g/ml，链霉素30-70μ g/ml，低温环境(O-1(TC)下运输至供者处。
[0077]2.收集月经血
[0078]将取自月经第二天的月经血倒入保存液中，低温环境(0_8°C )转移到实验室处理
[0079]3.分离提取宫膜干细胞
[0080](I)准备5-10mL淋巴细胞分离液，将等体积的样品缓慢加到分离液上层，密度梯度离心，300-500g，20-40分钟(加速度和减速度均设为1，温度为10_30°C);
[0081](2)离心结束后移去上清，小心取中间白膜层至另一洁净离心管中，加3_5mL PBS或Hanks液吹打，冲洗，1000-1500rmp离心5_10分钟，重复2_3次除菌；
[0082](3)获得的单核细胞用ImL左右完全培养液(a -MEM+双抗+两性霉素+20%胎牛血清)吹打悬起；
[0083](4)细胞悬液接种至六孔板中，补加培养液至3mL，放入37°C、5%C02培养箱中进行原代培养。
[0084]实施例2.宫膜干细胞的平皿培养扩增
[0085]当细胞长满平皿的80%时，弃去原培养液，用PBS洗涤2遍，加入覆盖皿底量的
0.25%含有EDTA的胰蛋白酶，消化3-4min，期间不间断用倒置显微镜观察，见胞质回缩、细胞间隙增大、细胞变圆，立即加入与胰酶等体积的细胞培养基终止消化，用吸管反复吹打贴壁细胞，将细胞吹打下来，1000r/min离心5min，再用细胞培养液重悬细胞，按照密度为5.0X IO5个细胞，接种到新的平皿中，加入新鲜细胞培养液于37°C、5%C02条件下培养，3天换液一次，得到2.0X IO6个细胞，细胞扩增3倍。
[0086]实施例3.宫膜干细胞在含微载体的转瓶中培养扩增
[0087]在本实施例中使用的是含有微载体的转瓶培养扩增细胞，转瓶工作体积为125ml，微载体为Cytodex-3。
[0088](I)转瓶预处理:125ml转瓶清洗干净，烘干至完全干燥，加入20ml硅化液(Sigmacote, Sigma)于转瓶中，缓慢旋转转瓶使娃化液浸润瓶壁，吸去娃化液后，将转瓶置于通风处风干12h，蒸馏水冲洗备用。
[0089](2)微载体预处理:本实施例中微载体密度为2g/L，由于培养体积为50ml，因此称取0.1g放入Cytodex-3转瓶中，加入20ml PBS浸泡3h，吸去后加入20ml新的PBS，121 °C高压蒸汽灭菌20min，吸去PBS并加入20ml含15%胎牛血清的a -MEM培养液，37°C浸泡过夜。
[0090](3)宫膜干细胞的接种:取4平皿生长至80%融合的宫膜干细胞，0.25%胰酶-EDTA消化后，以15%胎牛血清的培养液终止消化，1000rpm离心5min，新鲜培养液重悬，以4X104个细胞/ml的密度接种在三维微载体上。将含有8 X IO6个细胞的悬液加入含有Cytodex-3的转瓶中，再分别补足培养液至25ml，置于Wheaton磁力搅拌器上间歇搅拌，间歇搅拌条件为45rpm搅拌2min，停止13min，如此循环3h，37°C，5%C02。接种结束后，分别补入25ml培养液至50ml最终工作体积，转速调整为55rpm，每2天更换2/3培养液直至培养结束。
[0091](4)宫膜干细胞的获取:停止转瓶内的搅拌，弃去上清液，0.25%胰酶-EDTA消化后，以含15%胎牛血清的培养液终止消化，1000rpm离心5min，用新鲜培养液重悬，得到
5.8X IO5个细胞/ml密度的细胞。
[0092]实施例4.搅拌式生物反应器扩增培养宫膜干细胞
[0093]在用平皿或转瓶小规模培养扩增宫膜干细胞达到足够的细胞数量后，转入搅拌式生物反应器进行扩增培养。
[0094](I)连接反应器气路管、进液管、出液管等管路，121°C高压湿热灭菌40min，打入新鲜的细胞培养液，搅拌2天进行培养液检菌；
[0095](2)微载体的水化过程:称取15g微载体置一干净容器中，使用无Ca2+，Mg2+的PBS在室温下水化过夜并不时温和搅拌。弃去上清，加入新鲜的无Ca2+，Mg2+的PBS，温和搅拌后洗涤2次，弃去洗涤的PBSjPA PBS，121 °C高压湿热灭菌20min ；
[0096](3)将预先水化、灭菌的微载体接种到3L培养液中；
[0097](4)挑选形态健康、生长良好的平皿生产细胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，按照6X IO5个/mL制成细胞悬液，半量接种至反应器中，调节反应器的温度、培养液pH、溶氧等参数，使细胞生长于最适宜环境进行细胞培养，80rpm转3min,静置12min,如此重复12个循环，结束后接种剩余细胞，以IOOrpm的转速连续培养；
[0098](5)细胞接种第2天，根据细胞的生长汇合情况判断是否进行灌注培养及灌注体积，一般灌注体积为反应器I个工作体积，之后可控制在l_2vvD ；
[0099](6)每天取样观察拍照，计算细胞数目。当细胞长满微载体表面，数目达到约
3.5 X IO6个/mL,细胞扩增5倍，停止培养；
[0100](7)收集约20mL培养液进行无菌检测；
[0101](8)通过反应器的微载体/细胞截留装置将高压液体排出，加入500mL PBS冲洗2-3次，将IOOmL胰酶/EDTA加入反应器，消化20min后加入等体积培养液终止消化；
[0102](9)吹打细胞与微载体的混合物，目测微载体沉降后吸出上清于离心管中，移出少量细胞悬液进行流式表面标志物鉴定；
[0103](10)离心，弃上清，加入适当体积的冻存液，调整浓度为IO6个/mL，分别取ImL细胞悬液加入到冻存管内，做好标记；
[0104](11)程序降温盒内加入25mL异丙醇，将冻存管放入其中，置于-80°C冰箱内过夜；
[0105](12)将冻存管取出放入液氮罐内冻存。
[0106]采用灌注模式进行培养，溶氧是细胞代谢中的重要参数，它可以影响细胞的产率，所以需要时常观测调节溶氧量使其维持在50%，此过程可通过计算机有序定量地控制加入动物细胞培养罐内的空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的流量使其保持最佳的比例来实现。
[0107]反应器的温度由计算机实时自动控制在37 ± 0.2 °C，pH控制在7.0-7.2。
[0108]搅拌式生物反应器扩增得到宫膜干细胞3.5 X IO6个/mL，细胞扩增5倍。
[0109]实施例5、固定床式生物反应器培养扩增宫膜干细胞
[0110]①米用美国BBA Fiberweb的Reemay公司(Old Hickory, TN, USA)生产的无纺布聚酯类纤维(Non Woven Polyester Fabric), N0.2214型,经表面处理并切割成直径为6mm的圆形小片体。
[0111]②细胞生物反应器选择的是购买自美国NBS公司的5L生物反应器CelligenPlus,工作体积3.5L，采用固定床篮式搅拌系统。在生物反应器中加入上述处理切割好的直径为6mm的圆形聚酯切片作为细胞载体，并加入磷酸缓冲液，121°C灭菌30min。灭菌后，排空磷酸缓冲液，加入含15%胎牛血清的a -MEM培养液，并开始控制细胞生物反应器条件。
[0112]③挑选形态健康、生长良好的宫膜干细胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，作为细胞生物反应器的种子细胞，以4Χ IO5个细胞/mL的密度接种到生物反应器中的无纺布/聚酯纤维圆形小片载体上，用细胞培养液进行扩增培养。其中聚酯纤维圆形小片载体的使用量为每升罐体积35g，所使用的细胞培养液为a-MEM培养基加15%胎牛血清。细胞生物反应器培养条件为酸碱度(pH)值7.2，温度37°C，溶氧浓度(DO)为空气饱和的50%，搅拌速度80rpmo[0113]④每天通过生化分析仪检测葡萄糖和乳酸含量等参数，接种后培养约8天，排空培养液，加入500mLPBS冲洗2_3次后，加入IOOmL胰酶/EDTA，消化20min，加入等体积培养液终止消化，收获细胞5 X IO6个/mL，扩增倍数为14倍。
[0114]实施例6、WAVE生物反应器
[0115]①采用GE的WAVE Bioreactor系统，它由一个带有一次性塑料细胞培养袋的摇动平台组成，配备CO2气体混合器(C02MIX20)或WAVEP0D?控制塔用于控制pH、温度、氧气和混合。将宫膜干细胞置于Cellbag-2L的生物反应器中培养。
[0116]②微载体预处理:微载体Cytodex 3用不含Ca2+和Mg2+离子的PBS中洗涤3次后，121°C高压灭菌15min，于4°C下无菌保存。微载体先用培养基洗涤并在接种前24h转移到Cellbag中进行平衡。所使用的微载体Cytodex 3量为3g/l。
[0117]③挑选形态健康，生长良好的宫膜干细胞用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，作为细胞生物反应器的种子细胞，以5X IO5个细胞/ml的密度接种到微载体上，用细胞培养液进行扩增培养。所使用的细胞培养液为a-MEM培养基加15%胎牛血清。细胞生物反应器培养条件为酸碱度(pH)值7.2，温度37°C，溶氧浓度(DO)为空气饱和的50%。
[0118]④每天通过生化分析仪检测葡萄糖和乳酸含量等参数，接种后培养约7天，排空培养液，加入500mLPBS冲洗2_3次后，加入IOOmL胰酶/EDTA，消化20min，加入等体积培养液终止消化，收获细胞。可得4X IO6个/ml的细胞，扩增倍数为8倍。
【权利要求】
1.一种宫膜干细胞规模化生产工艺，包括以下步骤: (1)宫膜干细胞的分离提取:月经血经密度梯度离心后，在含胎牛血清细胞培养液的培养器皿中，在37°C、5%C02条件下进行原代培养； (2)宫膜干细胞的培养扩增:将步骤(1)获得的原代细胞以0.5X IO6-L 5X IO6个细胞/cm2的密度接种于二维培养器皿中，加入新鲜细胞培养液，于37°C、5%C02条件下培养，3天换液； (3)宫膜干细胞的大规模培养:将步骤(2)获得的宫膜干细胞接种在转瓶或生物反应器中，调整溶解氧浓度、PH值、搅拌转速和通气量，根据取样分析细胞计数、存活率、营养成分和代谢物的结果更换培养基，从而达到细胞的高密度大规模培养； (4)宫膜干细胞的检测:进行干细胞特性、无菌性、支原体、衣原体检测； (5)宫膜干细胞的冷冻保存:将检测合格的细胞冻存于管内，细胞的详细信息扫描入数据管理系统，自动化系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中； (6)根据需要，进行长期冷冻保存，并定期从冻存环境中取出细胞进行复苏检测。
2.如权利要求1所述的宫膜干细胞规模化生产工艺，其中所述步骤(1)中月经血经密度梯度离心后用无菌PBS冲洗3-4次；所述细胞培养液包含a -MEM+双抗+两性霉素+20%胎牛血清。
3.如权利要求1所述的宫膜干细胞规模化生产工艺，其中所述步骤(2)中的二维培养器皿选自细胞培养孔板、培养皿和T瓶。·
4.如权利要求1所述的宫膜干细胞规模化生产工艺，其中所述步骤(3)中，调节溶解氧浓度为40%-60%、pH值为6.8-7.2、搅拌转速为80_120rpm。
5.如权利要求1所述的宫膜干细胞规模化生产工艺，其中所述步骤(3)中所述的转瓶培养按以下过程进行:将微载体经预处理、转瓶硅化、121°C高温灭菌后，接种细胞，微载体加入量为3-20g/L，微载体的大小范围为60-300 μ m,接种密度为2 X 105-6 X IO5个细胞/ml，转瓶的大小范围为25ml-500ml，转速范围50-75rpm/min，培养方式是分批培养。
6.如权利要求1所述的宫膜干细胞规模化生产工艺，其中所述步骤(3)中所述的生物反应器选自细胞培养生物反应器包括搅拌式生物反应器、固定床生物反应器和WAVE生物反应器。
7.如权利要求6所述的宫膜干细胞规模化生产工艺，其中所述微载体生物反应器按以下过程进行细胞培养:将微载体用PBS冲洗2次，第三次加入PBS放入4°C冰箱内平衡水化过夜，高压蒸汽灭菌后，接种宫膜干细胞，微载体的加入量为3-20g/L，接种密度为IO5-1O6个细胞/mL，细胞扩增至密度为5X 106-5X IO7个细胞/mL。
8.如权利要求1所述的宫膜干细胞规模化生产工艺，其中所述步骤(5)中输入的细胞详细信息包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期；所述冷冻保存包括将所获得的宫膜干细胞按IX IO7IX IO7个/ml细胞密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，经过程序降温后，将冻存管转移至-196°C液氮中冷冻保存，所述冻存液组分及体积比为DMSO:胎牛血清:a -MEM培养液=1:2:7。
9.如权利要求1所述的宫膜干细胞规模化生产工艺，其中所述步骤(6)中的复苏检测包括 CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD 59、CD81、CD105、CD166 及 HLAI 类中至少一个表面标志物的检 测。
【文档编号】C12N5/074GK103849596SQ201210517322
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】杜明明, 陈彦田, 齐瀚实 申请人:上海坤爱生物科技有限公司