法酶标仪对各个实验组和空白对照组进行0D值检测，取均数， 绘制干细胞生长曲线，结果见图4。实验结果表明间充质干细胞能够正常增殖。
[00測 实施例4
[0040] 厮带来源的间充质干细胞的多向分化潜能研究
[0041] 将待检测细胞接种在12孔板中，分别使用对照培养基及成骨诱导分化，成脂诱导 分化培养基，之后持续观察，待细胞形态转变，进行染色鉴定。成脂诱导至第21天左右，进 行油红0染色，结果见图5。成骨诱导至第28天左右，进行茜素红染色，结果见图6。实验 结果表明间充质干细胞具有向成骨方向分化和向成脂方向分化的多向分化潜能。
[004引 实施例5
[0043] 对小鼠移植厮带来源的间充质干细胞的实验
[0044] 将60只体重为20-30g的C57小鼠，平均分为4组，其中45只进行造模，15只作为 正常对照组。设定为W下处理方式：
[0045]
[004引造模情况：
[0047] 对各组小鼠分笼标记，禁食过夜后称重，之后正常食水，勤换垫料。
[0048] 第Η天时，禁食4小时，测空腹血糖，相关结果见图7,从图7可W看到Η个造模组 较正常对照组血糖显著升高，组间无显著性差异，造模成功。造模后第一周，进行细胞移植 治疗。正常对照组按照常规流程饲养。
[0049] 将厮带间充质干细胞转化成转化目细胞的方法是：将冷冻存储的厮带间充质 干细胞复苏，洗涂后在细胞培养皿中培养，培养基成分为DMEM高糖培养基，得到贴壁生 长的厮带间充质干细胞；添加胎牛血清FBS和碱性成纤维生长因子bFGF ;3天后，细胞 均贴壁，用PBS清洗3次，更换培养基成分为无血清DMEM/F12 ;并根据W下浓度添加四 种腺病毒；PdXl ;2. 96X l〇SlU/ml，Mafa ;8. 52X l〇9lU/ml，N即3 点 24X l〇9lU/ml ;F0XA2 : 4. 35X 109IU/ml，在5% (?的培养箱内培养3天，诱导过程结束，获得间充质干细胞诱导分 化为的膜岛目细胞。
[0050] 厮带间充质干细胞的处理方法；将厮带间充质干细胞复苏，洗涂，重悬于保存注射 液中，进行计数，按照约10^只鼠的剂量进行分装，分别用10 μ 1长颈电泳吸头吸入细胞 液，然后使细胞自然沉降于吸头颈部，自上吸去多余液体。
[0051] 膜岛目细胞的收获，离必，计数，按照同样的方法进行准备。
[0052] 移植手术方式：小鼠做好背部刹毛及消毒工作，保证手术室环境消毒。剪开小鼠背 侧左肾脏部位皮肤，露出肾脏后，按压周围，挤出肾脏，无菌生理盐水保持湿润，肾包膜剪开 小口，将准备好的内有细胞的塑料吸管插入肾包膜，W液相针导入，移植后回纳肾脏，缝合 皮肤，做好表面消毒。
[0053] 移植手术当天，W及术后每周进行一次空腹血糖检测，应用血糖仪及试纸，尾静脉 采血监测，并记录结果，结果见图8。
[0054] 根据两个月的定期监测，可W看到假手术移植组和UMSCs移植治疗组的血糖值和 造模后无明显差异，保持在较高的水平，说明膜岛功能没有恢复，无法进行血糖调节，对1 型糖尿病无治疗作用。
[00巧]膜岛目细胞肾包膜内移植组，造模后该组动物血糖升高，但移植治疗后，血糖逐 渐平稳下降，和正常对照组相比基本重合，说明了分化后膜岛目细胞移植在1型糖尿病动 物模型体内实验具有良好的治疗效果。
[0056] 膜岛素水平需提取血清，考虑小鼠血量少，每月监测一次，小鼠空腹后喂食约比， 应用毛细吸管采血，每只眼底静脉丛取血50 μ 1左右，可W得到血清大约20 μ 1，经过稀释， 使用ELISA方式检测，结果见图9。
[0057] 从血清膜岛素水平可W看出，实验小鼠进食后，各组血清膜岛素水平就出现差异， 移植细胞当日（Iw)正常对照组小鼠血清膜岛素明显上升，而Η个造模组均无明显上升，表 明造模后小鼠膜岛无正常产生膜岛素功能。4w时，可W看到假手术组血清膜岛素水平无明 显改变，膜岛目细胞移植和正常对照组的血清膜岛素水平差别不大，而UMSCs移植组有一 定的膜岛素分泌。8w时第Η次检测，可W看到膜岛目细胞移植组血清膜岛素水平有一定降 低，而正常对照组水平升高，送些可能和进食量，膜岛目细胞存活时间等因素相关。
[0058] W上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 属于本技术领域的技术人员在本发明掲露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该W权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂，其特征在于，该干细胞制剂包含从人脐带中分 离提取的间充质干细胞，该间充质干细胞经诱导后能够分化成胰岛β细胞。2. 根据权利要求1所述的一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂，其特征在于，所述间充 质干细胞的细胞表面标记⑶73、⑶90、⑶105的表达均高于95%，细胞表面标记⑶14、⑶34、 ⑶45、⑶19和HLA-DR的表达均低于3%。3. 根据权利要求1所述的一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂，其特征在于，所述间充 质干细胞是在分离提取后进一步经体外传代培养的干细胞。4. 根据权利要求1所述的一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂，其特征在于，所述间充 质干细胞在显微镜下呈长梭形，包浆透亮，胞体小，有立体感。5. 根据权利要求1所述的一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂，其特征在于，所述间充 质干细胞具有向成骨方向分化和向成脂方向分化的多向分化潜能。6. -种制备权利要求1所述的用于治疗糖尿病的干细胞制剂的方法，其特征在于，包 括以下步骤： (1) 从脐带中分离提取间充质干细胞； (2) 间充质干细胞的原代培养； (3) 间充质干细胞的传代培养； (4) 将步骤（3)获得的间充质干细胞制成干细胞制剂； (5) 干细胞制剂的质量检测。7. 根据权利要求6所述的制备干细胞制剂的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的 分离提取包括以下步骤：在超净工作台中操作，将新鲜获取的脐带用乙醇进行消毒，再用生 理盐水清洗脐带，分离剥除脐带血管，获得华通氏胶部分。8. 根据权利要求6所述的制备干细胞制剂的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的 原代培养包括以下步骤：将华通氏胶剪碎，稀释后种瓶，在二氧化碳培养箱中采用组织贴壁 法培养，通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，待细胞融合度达到70-80 %即可收获原代细 胞。9. 根据权利要求6所述的制备干细胞制剂的方法，其特征在于，所述干细胞制剂的质 量检测包括细菌、真菌、支原体、病毒、内毒素、热源检测及细胞活性检测。
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂，它包含从人脐带中分离提取的间充质干细胞，干细胞的细胞表面标记CD73、CD90、CD105的表达均高于95％，细胞表面标记CD14、CD34、CD45、CD19和HLA-DR的表达均低于3％。该干细胞制剂经诱导能够分化成胰岛β细胞，分泌胰岛素，有效降低血糖浓度，从而为克服糖尿病依赖胰岛素治疗、根治糖尿病提供了新的方法。本发明还提供该干细胞制剂的制备方法，该方法操作简单，原料来源广泛，不受伦理限制，可以进行规模化生产。
【IPC分类】A61K35/44, A61P3/10, C12N5/0775
【公开号】CN105456293
【申请号】CN201410451828
【发明人】胡祥, 李陶, 刘沐芸, 李婵, 丁长才
【申请人】深圳市北科生物科技有限公司, 辽宁北科生物科技有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年9月5日