一种从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从脐带华通氏胶提取间充质干细胞 的方法。
【背景技术】
[0002] 正常人的脐带含有三条血管：两条脐动脉（PluralArteriae umbilicales)和一 条脐静脉（Vena umbilicalis)。两条动脉将二氧化碳丰富和营养少的血输入胎盘，静脉将 氧气和营养丰富的血液输回胎儿。另一条动脉在胎儿的第一周就退化了。动脉输送静脉血 (富含二氧化碳和废物的血）、静脉输送动脉血（富含氧气和营养的血）的血管除肺动脉/ 静脉外就只有脐动脉/静脉。人的脐带约50至60厘米长，直径约2厘米，脐带内的血管由 华通氏胶（Wharton's Jelly)包裹，华通氏胶中有干细胞。
[0003]间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属 于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植 入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特 定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组 织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰 老和病变引起的组织器官损伤修复
[0004] 目前，已经进行的临床试验研宄证实，在终末期肝病治疗中，MSCs移植能够明显改 善患者的肝功能；而将皮肤角质细胞与MSCs混合后进行移植，可有效延长移植皮肤的存活 时间并减少异体移植物抗免疫疾病（graft versus host disease，GVHD)。对于SCs免疫 调节机制的研宄认为，MSCs主要通过旁分泌作用，产生多种免疫调节因子，作用于免疫细胞 后，诱导免疫耐受，从而发挥调控机体的免疫的作用。
[0005] 此外，通过将MSCs进行基因修饰，把IFNf3、EP0等基因导入其基因组中，可获得 能够在体内长时间稳定表达该蛋白或细胞因子的功能性细胞。吴祖泽等人把HGF的基因导 入MSCs中，体内外实验证实HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持原有的增殖和分化能力，而 对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，因此在组织器官移植中存在更大的潜在应用价 值（边莉，郭子宽，艾辉胜，王华，孟二红，吴祖泽，王立生；HGF基因修饰增强间充质干细胞 的免疫抑制作用；军事医学科学院院刊；2006, 30(4) :323-328)。正因如此，目前各国均投 入大量人力物力经费进行广泛和深入的研宄。但所有的研宄或治疗方案都必须建立在足够 量MSCs获取的基础上，因此建立稳定有效快速的MSCs分离、扩增、质量控制的技术体系具 有重要的意义。
[0006]在人体组织中，骨髓中存在大量的MSCs，然而随着年龄老化，自体骨髓中的MSCs 的数目会显著降低、且增殖能力也会大幅衰退。同时，为保证自体或供体安全，对骨髓MSCs 的采集技术要求严格，配套仪器精密、成本高，不宜应用推广。因此，对于骨髓以外来源的研 宄越来越被重视。目前，不同的研宄已经从围产期的胎盘、脐带、脐带血，抽脂术来源的脂肪 以及流产胎儿中分离获得增殖能力好、低免疫原性的MSCs。而这些组织中，脐带属于医疗废 弃物，具有易于获得、来源稳定可控、无伦理争议问题的特点，具有良好的研宄价值和应用 前景。
[0007]目前对于脐带间充质干细胞分离的方法主要有贴壁法和酶消化法两种。其中贴壁 法操作简便，对实验条件要求最低，是最易于推广的方式。然而，获得原代细胞周期长、不可 避免混杂部分内皮细胞，需后期通过酶消化法进一步进行筛选，因此仍有待于进一步改进。 而酶消化法获得较高纯度的MSCs，但获取的效率较低、单细胞贴壁能力弱、生长速度较慢。
[0008] 除了分离培养方法，MSCs培养基同样对细胞获得效率以及细胞质量至关重要。在 目前已知来源中，MSCs含量极低，因此为获得足够数量的MSCs，不但需要对分离方法进行 优化，增加细胞得率，同时需要对获得的MSCs进行体外培养和传代扩增。含血清培养基虽 然可以在较短时间内大量扩增MSCs，但动物血清所带来的异源性污染可为临床MSCs的应 用带来风险。因此，无血清培养基越来越受到关注。相比起来，无血清培养基成分确定，批 次稳定，更容易实现细胞应用中的安全性和可控性。但目前无血清培养基存在的普遍问题 在于对原代细胞的贴壁和生长支持能力不足。
【发明内容】
[0009] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的 方法。
[0010] 一种从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
[0011] 1)用含氨基青霉素和硫酸链霉素的PBS缓冲液对新生儿脐带组织进行充分的清 洗，去除污血；
[0012] 2)将脐带进行机械分离，得到剥离的华通氏胶；
[0013] 3)将华通氏胶轻微粉碎，加入胶原酶A，置于C02培养箱中消化处理；
[0014] 4)消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残 留酶，再次进行离心分离，弃去上层清液；
[0015] 5)将下层液进行缓慢降温，以每分钟降低1°C的速率降低至2~6°C;
[0016] 6)加入胰酶，置于C02培养箱中消化处理，加入PBS缓冲液混勾，离心分离，弃去上 层清液；
[0017] 7)用培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于C0 2培养箱培养， 然后离心分离获得组织块和细胞重悬液。
[0018] 优选的，所述培养基为用于培养间充质干细胞的无血清培养基，以所述用于培养 间充质干细胞的无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成：
[0019] a -MEM10. 3g/L、碳酸氢钠2. 4g/L、碳酸钠1. 8g/L、磷酸一氢钠2. Og/L、磷酸二氢 钠1. 6g/L、L-谷氨酰胺2-8mM、重组人白蛋白2-8g/L、重组人转铁蛋白10-20mg/L、重组人 胰岛素5-15mg/L、|3 -疏基乙醇50nM、谷胱甘肽0? l-3mg/L、对氨基苯甲酸0? 2-5mg/L、维生 素 B 25-40mg/L、维生素 C20-50mg/L、黄体酮 10-20ng/mL、腐胺 5-10mg/L、肝素 5-10IU/mL、 ￡6卩5-10耶/11^、13-?6?5-1〇1^/1^、1??5-1〇1^/1^、￥￡6?5-1〇1^/1^、脂质0.1-111^/1、微量元素 l-10mg/L 及式 I 化合物 5-10 y M。
[0020] 优选的，所述式I化合物的结构式如下：
[0021]
【主权项】
1. 一种从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 用含氨基青霉素和硫酸链霉素的PBS缓冲液对新生儿脐带组织进行充分的清洗，去 除污血； 2) 将脐带进行机械分离，得到剥离的华通氏胶； 3) 将华通氏胶轻微粉碎，加入胶原酶A，置于CO2培养箱中消化处理； 4) 消化处理之后，进行离心处理并收集细胞和残余组织，利用PBS缓冲液洗去残留酶， 再次进行离心分离，弃去上层清液； 5) 将下层液进行缓慢降温，以每分钟降低1°C的速率降低至2~6°C ; 6) 加入胰酶，置于CO2培养箱中消化处理，加入PBS缓冲液混匀，离心分离，弃去上层清 液； 7) 用培养基重悬组织和细胞，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO2培养箱培养，然后 离心分离获得组织块和细胞重悬液。
2. 根据权利要求1所述的从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法，其特征在于，所 述培养基为用于培养间充质干细胞的无血清培养基，以所述用于培养间充质干细胞的无血 清培养基的体积计，其包括以下成分组成： α-ΜΗΜΙ 0. 3g/L、碳酸氢钠2. 4g/L、碳酸钠1.8g/L、磷酸一氢钠2. Og/L、磷酸二氢钠 1.6g/L、L-谷氨酰胺2-8mM、重组人白蛋白2-8g/L、重组人转铁蛋白10-20mg/L、重组人胰 岛素5-15mg/L、|3-疏基乙醇50nM、谷胱甘肽0.1-3mg/L、对氨基苯甲酸0.2_5mg/L、维生 素 B 25-40mg/L、维生素 C20-50mg/L、黄体酮 10-20ng/mL、腐胺 5-10mg/L、肝素 5-10IU/ mL、EGF5-10ng/mL、b-FGF5-10ng/mL、HGF5-10ng/mL、VEGF5-10ng/mL、脂质 0· 1-lmg/L、微量 元素 l-10mg/L及式I化合物5-10 μ Μ。
3. 根据权利要求2所述的从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法，其特征在于，所 述式I化合物的结构式如下：
4. 根据权利要求2所述的从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法，其特征在于，所 述脂质包括胆固醇、花生四烯酸、原儿茶酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻 酸中的一种或几种的组合；所述微量元素包括Mg、Cu、Zn、Se、Fe、Sn、Ni、Ge、Zr、Rb、Co和 Mn中的任意一种或多种的混合。
5. 根据权利要求1至4任一所述的从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法，其特征 在于：在所述含氨基青霉素和硫酸链霉素的PBS缓冲液中，所述氨基青霉素和硫酸链霉素 的总质量百分比浓度为1-6%。
6. 根据权利要求1至4任一所述的从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法，其特征 在于：在所述步骤3)中，所述胶原酶A的浓度为I. 5mg/mL-4. 5mg/mL，胶原酶A的添加量为 每15-20g的华通氏胶添加20mL，消化处理的时间为4-6小时。
7.根据权利要求1至4任一所述的从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法，其特征 在于：在所述步骤6)中，所述胰酶的浓度为0.03%-0.3%，添加量为每15-20g的华通氏胶 添加20mL，消化时间为20-25分钟。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法。该方法包括华通氏胶的分离、华通氏胶的消化、消化后液的离心分离、分离液的低温处理、低温处理后液的离心分离、培养等步骤。本发明所提供的从脐带华通氏胶提取间充质干细胞的方法是一种高效高纯度获得脐带间充质干细胞的方法，通过利用酶消化结合明胶铺被提高脐带间充质干细胞的得率和纯度，有效缩短分离获得时间，以实现快速制备和鉴定的方法，可获得以往培养方法更高的得率。
【IPC分类】C12N5-0775
【公开号】CN104762256
【申请号】CN201510135941
【发明人】王锐峰
【申请人】湖北省生命源干细胞有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月26日