一种从脐带制备间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从脐带制备间充质干细胞的方法，尤其涉及从脐带的羊膜下层组 织分离间充质干细胞，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据个体发育过程中出现的 先后次序不同，分为胚胎干细胞（ESC)和成体干细胞（ASC)。胚胎干细胞是从囊胚的内细胞 团中分离出来的细胞，能够无限自我更新，可分化为内、中、外3个胚层的各种细胞和组织。 但由于干细胞研宄的胚胎来源困难、本身具有致瘤性、免疫排斥及伦理等问题而限制了其 在临床的应用。随着干细胞技术的发展，现在己证实可以将成体的终末分化细胞通过导入 几个关键的因子使其再编程为胚胎干细胞样的细胞，这种细胞被称为诱导性多能干细胞， 它可以绕过伦理道德问题，但因为需要借助病毒载体导入基因，有编程效率低、成瘤性等问 题，从而限制了它们在临床上的应用。成体干细胞是存在于胎儿、儿童和成人组织中的多能 干细胞的统称，现在已经在多种组织器官被发现，如造血干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、 心脏干细胞及间充质干细胞（MSC)等。一般认为，成体干细胞只能分化为其组织器官的细 胞类型，然而近几年的研宄表明，这些干细胞的分化能力远超过传统观点局限的范围，如神 经干细胞可以分化为血液细胞，脐带血干细胞可以分化为神经细胞等。
[0003] 间充质干细胞是来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间 质中，具有良好的增殖能力和多向分化潜能。在不同的诱导条件下，间充质干细胞不但可分 化为软骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪等中胚层细胞，同时还可向外胚层的神经细胞和内胚层的 肝卵圆性细胞及多种细胞和组织分化。间充质干细胞易于分离和培养，易于外源基因的导 入和表达，分泌的多种细胞因子具有调节免疫、支持造血的特性，免疫原性弱，遗传背景稳 定并且不受胚胎干细胞研宄中遇到的伦理问题限制。因此，间充质干细胞是组织工程、基因 工程和细胞治疗的理想种子细胞来源。
[0004]目前已经进行的临床试验研宄证实，具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细 胞可以应用于多种疾病的治疗和康复。但是，所有的研宄或治疗方案都必须建立在获得足 量间充质干细胞的基础上，快速有效的分离间充质干细胞作为种子细胞具有非常重要的研 宄价值和经济利益。在研宄和实际应用中发现种子细胞存在种种问题，例如，自体骨髓虽然 存在大量的间充质干细胞，但随着年龄增大，自体骨髓中的间充质干细胞数目会显著降低， 且增殖能力也会大幅衰退，同时，从骨髓采集间充质干细胞操作复杂，不宜应用推广。
[0005] 因此，研宄者开始寻找间充质细胞的其他来源，其中，脐带间充质干细胞来源充 足、病毒污染概率低、免疫源性弱、细胞更为原始，也不存在社会、伦理和法律方面的争议。 人脐带连接于母体和胎儿之间，妊娠期间为胎儿提供营养，主要由三部分构成：羊膜被覆上 皮、脐带血管和位于两者之间被称为华通氏胶（Wharton' s Jelly)的黏液结缔组织。脐带 间充质干细胞的主要的来源是华通氏胶和脐血。
[0006]目前对于脐带间充质干细胞分离的方法主要有贴壁法和酶消化法两种。其中贴壁 法操作简便，对实验条件要求低，容易掌握。这种方法的缺点在于，获得原代细胞的周期长， 液体的浮力使组织块漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量，此外，产物中混 有部分内皮细胞，需要通过后期的酶消化处理进行进一步的筛选。采用胶原酶消化法虽然 可在短时间内获得细胞，杂质少，但费用较高，并且条件不易掌握，如果常温中消化时间长 可能损伤细胞，致使细胞不易贴壁和传代；如果消化时间短则液体粘稠，难以通过离心获得 足够量细胞。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种不采用消化酶又不同于常规贴 壁法的脐带间充质干细胞制备方法。本发明的发明人通过对脐带中不同的间充质干细胞来 源、实验条件等进行了大量研宄和探索，发现从脐带的羊膜下层组织可以制备出高纯度、高 活性的间充质干细胞。本发明的发明人还对实验条件进行了优化，发现分离出羊膜下层组 织后先不加细胞培养液在38. 5°C培养一段时间，然后再加入细胞培养液培养，可以显著提 高间充质干细胞的回收率。本发明的方法操作简单，得到的间充质干细胞纯度高，具有增强 的自我更新及多向分化潜能。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明提供一种从脐带制备间充质干细胞的方法，包括 下述步骤：（1)取脐带样品；（2)去除血管以及其周围紧贴血管的组织；（3)制备脐带组织 片；（4)分离羊膜下层组织；（5)对羊膜下层组织进行处理；(6)不加细胞培养液进行培养； (7)加入培养液继续培养；(8)胰酶消化；(9)过滤；（10)将滤液离心并去除上清，重新悬浮 获得脐带组织间充质干细胞。
[0009] 优选的，本发明的方法包括下述步骤：（1)取新生儿的脐带，用含青霉素和链霉素 的磷酸盐缓冲液反复冲洗干净，去除残留的血液，获得干净脐带；（2)将干净的脐带用手术 刀纵向切开，用镊子去除静脉血管和动脉血管以及其周围紧贴血管的组织；（3)将剩下的 组织摊平，脐带内侧朝上，用镊子小心剔除脐带内侧胶质部分，剥除干净，直至剩下约1mm 厚度的组织片；(4)固定脐带组织片靠表皮一侧，用镊子撕下脐带内侧整齐的组织层即羊 膜下层组织，剩下薄薄一层透明的脐带表皮即羊膜层组织；（5)将羊膜下层组织用剪刀剪 成约lcm 2的组织片，将靠近表皮侧贴在培养皿中整齐排开；(6)不加细胞培养液，直接放置 于5% C02、38. 5°C培养箱内，静置一小时后，倒置两小时；(7)然后加入细胞培养液5mL，置 于5% C02、37°C培养箱内继续培养，当组织片周围的细胞达到80%融合时，将培养皿从培 养箱内取出；(8)胰酶消化：先用磷酸盐缓冲液清洗培养皿两次，吸弃洗液，吸取含0. 25% 胰酶和0. 1 % EDTA的磷酸盐缓冲液，加入到培养皿内，消化3~5分钟，再将细胞培养液 加入到培养皿中，反复吹打，使脐带组织间充质干细胞进入消化液中；(9)将消化液经100 目灭菌滤网过滤，去掉脐带组织片，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；（10)将滤液在 900rpm下离心5分钟，去除上清，重新悬浮细胞，获得脐带组织间充质干细胞。
[0010] 优选的，上述方法中的磷酸盐缓冲液的组成如下：8g/L NaCl，0. 2g/L KC1，1. 15g/ L Na2HP04,0. 2g/L KH2P04, pH 7. 4。
[0011] 优选的，上述方法中含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，青霉素的浓度为l〇〇U/ ml，链霉素的浓度为0. lmg/ml。
[0012] 优选的，上述方法中的细胞培养液是包含10-30%胎牛血清和5-151^/11^￡6?的 D-MEM/F12培养液。更优选的，所述细胞培养液是包含20%胎牛血清和lOng/mL EGF的 D-MEM/F12 培养液。
[0013] 本发明还包括利用上述方法制备的间充质干细胞。
[0014] 对于根据本发明所述方法制备的间充质干细胞，按照"国际细胞疗法协会"（ISCT) 制订的标准进行生物学表型鉴定，表现出以下技术特征：
[0015] ①标准培养条件下粘附于塑料培养器皿成纤维样生长；
[0016] ②表达 CD29, CD44, CD90, CD105,不表达 CD31，CD34, CD45, CD71 ;
[0017] ③体外可诱导分化为神经细胞。
[0018] 脐带的羊膜下层组织是位于脐带中羊膜下层部位的组织，即羊膜层和华通氏胶之 间的组织（参见图1)。上述鉴定结果表明本发明从脐带的羊膜下层组织中分离的干细胞属 于间充质干细胞，而不含造血干细胞。
[0019] 按本发明方法制备的原始干细胞因其所用材料来源和成品细胞的性能，可以解决 在干细胞应用领域目前困扰医学界的多项难题。本发明的方法不采用消化酶，避免了间充 质干细胞分离过程中，消化酶对脐带间充质干细胞引入动物源蛋白和动物源病原物的污染 风险，又比普通的贴片法获得