一种脐血干细胞的体积离心分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脐血干细胞的体积离心分离方法。
【背景技术】
[0002] 国内、外分离脐带血干细胞方法常采用磁珠/流式细胞分选法、脐血库仪器/羟乙 基淀粉沉淀法和密度梯度离心法。由于目的不同，各类方法有其自身特点。磁珠法或流式 细胞分选法应用相应单克隆抗体分离得到较纯的细胞群体，但细胞收获率较低，适宜做分 析及科研应用。脐血库分离干细胞常用羟乙基淀粉沉淀和仪器离心分离法，分离的细胞量 大成分较多但混有大量红细胞，适用于大量分离、储存干细胞。
[0003] 干细胞分离过程中的各种实验条件，如：离心力、离心时间、分离液与稀释脐带血 比例、温度、试剂准备等环节各家报道差别很大，更无客观和科学的标准。建立一套优化的 最佳分离流程即标准操作流程是脐带血干细胞临床应用中亟待解决的方法学问题。
[0004] 脐血由于其来源容易，所含细胞种类和数量比较多，比骨髓和外周血中的细胞更 为原始，且其临床应用不涉及社会、伦理、法律方面的限制等优势。应用脐血造血干细胞治 疗血液系统疾病，无论技术、方法，还是基础研宄均比较成熟。脐血间充质干细胞可以分化 为成骨、软骨、脂肪细胞等，内皮干/祖细胞治疗缺血性疾病，已经在临床有突出的疗效。国 内、外分离脐血干细胞方法常采用磁珠/流式细胞分选法、脐血库仪器/羟乙基淀粉沉淀法 和密度梯度离心法。由于目的不同，各类方法有其自身特点。磁珠法或流式细胞分选法应 用相应单克隆抗体分离得到较纯的细胞群体，但细胞收获率较低，适宜做分析及科研应用。 脐血库分离干细胞常用羟乙基淀粉沉淀和仪器离心分离法，分离的细胞量大、成分较多但 混有大量红细胞，适合用作大量分离、储存干细胞。密度梯度离心法多采用Perc 〇ll、Fic〇ll 分离液分离细胞，得到单个核细胞群，该细胞群成分复杂，纯度不高[8-9]。但密度梯度离心 法分离脐血单个核细胞由于细胞得率高、方法简单等突出优点，有望成为制备临床级干细 胞的优选方法，分离介质以聚蔗糖泛影葡胺最为常用。应用脐血分离干细胞的目的是获得 以干细胞为主要群体的单个核细胞群。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种脐血干细胞的体积离心分离方法。
[0006] 一种脐血干细胞的体积离心分离方法，包括如下步骤：
[0007] 1)羟乙基淀粉沉淀红细胞；
[0008] 2)以内置有Pt丝滤网的离心机进行体积离心分离单个核细胞。
[0009] 优选的，所述步骤1)为：取枸橡酸钠抗凝脐血80~100ml，无菌操作加入500ml 圆形沉降瓶中，加脐带血量1~3倍体积的PBS，充分混匀，加脐带血量，1. 5倍体积的医用 6%中分子羟乙基淀粉130/0. 4氯化钠注射液，充分混匀，盖盖，18°C，静置60min。
[0010] 优选的，所述步骤1)为：将6%的羟乙基淀粉分别按照脐血血量的1/5加入到采 集来的血袋中；混合均匀后使用无菌封口胶密封穿刺点，倒置与12°C的低温环境中静置 5~8小时；分离好后先将脐血下层的红细胞缓慢的放出，取50ml离心管置于其中，然后将 血浆放入另一只50ml离心管中；把盛有红细胞的离心管，室温、600r/min离心5~8分钟， 把上层的血浆部分吸出后置于另一只盛有血浆的50ml离心管中，将剩下的红细胞丢弃即 可；把收集血浆的离心管，室温、600r/min离心5~8分钟，取上清部分保留在50ml离心管 中，将下层红细胞去除；将上步中收集的上清液室温、1200r/min离心10~20分钟，将含有 核细胞下层部分浓缩至约5ml，用PBS将体积调整至25ml。
[0011] 更优选的，所述步骤2)为吸取羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液，缓慢加至分离 液液面上，置水平离心机上，4°C，离心力700g，离心30min，离心后用移液管伸到单个核细 胞层，轻轻吸出，加入到PBS液中，4°C，洗涤细胞3遍，即得浓缩。
[0012] 优选的：在所述水平离心机的内表面设置有一层Pt丝滤网，所述Pt丝滤网的孔径 为 15 ~25 y m〇
[0013] 优选的：在以所述水平离心机进行体积离心时，对Pt丝滤网还周期性的通微弱的 电流，通电方式为每5秒为一个周期，周期内持续通电，电压为3~5 y V，相邻的两个周期间 隔10秒。
[0014] 本发明的分离液和分离流程可分离得到脐带血中最大比例的间充质干细胞，获得 的细胞状态好、活力高。可直接应用于临床治疗或进一步培养、扩增。还可用于外周血、骨 髓间充质干细胞细胞的分离提取。该方法为优化的流程，简单、易行，稳定性好，重复性好， 可广泛推广应用。
【具体实施方式】
[0015] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限 定本发明的范围。
[0016] 实施例1
[0017] 脐血干细胞的体积离心分离
[0018] 取枸橼酸钠抗凝脐血100ml，无菌操作加入500ml圆形沉降瓶中，加脐带血量2倍 体积的PBS，充分混匀，加脐带血量，1. 5倍体积的医用6%中分子羟乙基淀粉130/0. 4氯化 钠注射液，充分混匀，盖盖，18°C，静置60min。
[0019] 吸取羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液，缓慢加至分离液液面上，置水平离心机 上，4°C，离心力700g，离心30min，离心后用移液管伸到单个核细胞层，轻轻吸出，加入到 PBS液中，4°C，洗涤细胞3遍，即得浓缩。
[0020] 在所述水平离心机的内表面设置有一层Pt丝滤网，所述Pt丝滤网的孔径为 20 y m。在以所述水平离心机进行体积离心时，对Pt丝滤网还周期性的通微弱的电流，通电 方式为每5秒为一个周期，周期内持续通电，电压为3 yV，相邻的两个周期间隔10秒。
[0021] 实施例2
[0022] 脐血干细胞的体积离心分离
[0023] 取枸橼酸钠抗凝脐血80,无菌操作加入500ml圆形沉降瓶中，加脐带血量3倍体积 的PBS，充分混匀，加脐带血量，1. 5倍体积的医用6%中分子羟乙基淀粉130/0. 4氯化钠注 射液，充分混匀，盖盖，18°C，静置60min。
[0024]将6%的羟乙基淀粉分别按照脐血血量的1/5加入到采集来的血袋中；混合均匀 后使用无菌封口胶密封穿刺点，倒置与12°C的低温环境中静置8小时；分离好后先将脐血 下层的红细胞缓慢的放出，取50ml离心管置于其中，然后将血浆放入另一只50ml离心管 中；把盛有红细胞的离心管，室温、600r/min离心8分钟，把上层的血浆部分吸出后置于另 一只盛有血浆的50ml离心管中，将剩下的红细胞丢弃即可；把收集血浆的离心管，室温、 600r/min离心8分钟，取上清部分保留在50ml离心管中，将下层红细胞去除；将上步中收 集的上清液室温、1200r/min离心20分钟，将含有核细胞下层部分浓缩至约5ml，用PBS将 体积调整至25ml。
[0025] 在所述水平离心机的内表面设置有一层Pt丝滤网，所述Pt丝滤网的孔径为 20 y m。在以所述水平离心机进行体积离心时，对Pt丝滤网还周期性的通微弱的电流，通电 方式为每5秒为一个周期，周期内持续通电，电压为3 yV，相邻的两个周期间隔10秒。
[0026] 实施例1和实施例2得到浓缩液经流式细胞仪分析的⑶34+CD45+，⑶14+，⑶3+， CD73+，D105+，CD29+，CD90+表型，结果下表：
【主权项】
1. 一种脐血干细胞的体积离心分离方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 羟乙基淀粉沉淀红细胞； 2) 以内置有Pt丝滤网的离心机进行体积离心分离单个核细胞。
2. 根据权利要求1所述的脐血干细胞的体积离心分离方法，其特征在于，所述步骤1) 为：取枸橡酸钠抗凝脐血80~100ml，无菌操作加入500ml圆形沉降瓶中，加脐带血量1~ 3倍体积的PBS，充分混匀，加脐带血量，1. 5倍体积的医用6%中分子羟乙基淀粉130/0. 4 氯化钠注射液，充分混勾，盖盖，18°C，静置60min。
3. 根据权利要求1所述的脐血干细胞的体积离心分离方法，其特征在于，所述步骤1) 为：将6%的羟乙基淀粉分别按照脐血血量的1/5加入到采集来的血袋中；混合均匀后使用 无菌封口胶密封穿刺点，倒置与12°C的低温环境中静置5~8小时；分离好后先将脐血下 层的红细胞缓慢的放出，取50ml离心管置于其中，然后将血浆放入另一只50ml离心管中； 把盛有红细胞的离心管，室温、600r/min离心5~8分钟，把上层的血浆部分吸出后置于 另一只盛有血浆的50ml离心管中，将剩下的红细胞丢弃即可；把收集血浆的离心管，室温、 600r/min离心5~8分钟，取上清部分保留在50ml离心管中，将下层红细胞去除；将上步 中收集的上清液室温、1200r/min离心10~20分钟，将含有核细胞下层部分浓缩至约5ml， 用PBS将体积调整至25ml。
4. 根据权利要求1或2或3所述的脐血干细胞的体积离心分离方法，其特征在于，所 述步骤2)为吸取羟乙基淀粉沉淀红细胞后的上清液，缓慢加至分离液液面上，置水平离心 机上，4°C，离心力700g，离心30min，离心后用移液管伸到单个核细胞层，轻轻吸出，加入到 PBS液中，4°C，洗涤细胞3遍，即得浓缩。
5. 根据权利要求4所述的脐血干细胞的体积离心分离方法，其特征在于：在所述水平 离心机的内表面设置有一层Pt丝滤网，所述Pt丝滤网的孔径为15~25ym。
6. 根据权利要求5所述的脐血干细胞的体积离心分离方法，其特征在于：在以所述水 平离心机进行体积离心时，对Pt丝滤网还周期性的通微弱的电流，通电方式为每5秒为一 个周期，周期内持续通电，电压为3~5yV，相邻的两个周期间隔10秒。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脐血干细胞的体积离心分离方法。该方法包括以下步骤：1)羟乙基淀粉沉淀红细胞；2)以内置有Pt丝滤网的离心机进行体积离心分离单个核细胞。发明的分离液和分离流程可分离得到脐带血中最大比例的间充质干细胞，获得的细胞状态好、活力高。可直接应用于临床治疗或进一步培养、扩增。还可用于外周血、骨髓间充质干细胞的分离提取。该方法为优化的流程，简单、易行，稳定性好，重复性好，可广泛推广应用。
【IPC分类】C12N5-0789
【公开号】CN104762262
【申请号】CN201510136457
【发明人】王锐峰
【申请人】湖北省生命源干细胞有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月26日