一种构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法
【专利摘要】一种构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法：冷冻干燥法制备不同浓度配比的壳聚糖-明胶支架，扫描电镜观察支架表面特征，测量支架的孔径大小、并计算孔隙率、吸水率以及相容性测定，选取适合脐血干细胞生长的支架，用磁珠分选的方法对人脐血CD34+细胞进行分离鉴定，将脐血CD34+细胞附着在壳聚糖-明胶支架上，或者将转染了细胞因子的骨髓基质细胞和脐血CD34+细胞附着在壳聚糖-明胶支架上，放入RCCS系统进行三维培养体系(3D)培养，倒置显微镜观察细胞形态，扫描电镜观察细胞在支架上的粘附生长状况，MTT法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞标志物，以及对分化所得的血小板进行形态及功能鉴定，并与二维培养体系(2D)进行比较。
【专利说明】一种构建三维培养体系诱导胳血干细胞向血小板分化的方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法，属于药 物制剂领域。
【背景技术】
[0002] 临床上，血小板的输注主要用于血液科以及外科手术患者。常常面临的状况是，患 者行干细胞移植或大手术后引发的血小板降低，需要血小板及时抢救，但偶尔也会出现无 法供给的情况，大大增加了患者死亡的发生。至今能够有效解决的方法仅仅是靠多做宣传， 鼓励志愿者来捐献。由于文化的差异，以及知识的缺乏，捐献全血的志愿者较多，捐献血小 板的人相比较少。目前血小板的主要来源是靠单采血小板和手工制备的血小板，单采血小 板对捐献者要求较高，而用全血制备的手工血小板需多人份混合，引起抗原抗体反应机率 较大，加之血小板体外22°C振摇保存期最长5d，故一直无法满足临床需求，因而运用体外 生成血小板作为一种血液代用品供临床使用，是目前研究的热点及其难点。
[0003] 长期以来，国内外专家对血小板的体外生成开展了大量的研究，并成功地实现了 用造血干/祖细胞（HSC / HPC)诱导分化巨核细胞来产生血小板。早期的研究主要致力于 传统的培养方式，用单核细胞或纯化的CD34+细胞，在静态培养皿中培养，并外源性添加细 胞因子，以优化培养条件，来达到扩增的效果。文献报道显示不同组合的细胞因子对扩增效 果有着显著差异，因子组合TP0+SCF+IL-3+IL-6在培养第7d时巨核细胞数量可扩增至39 倍，因子组合TP0+SCF+IL-3在培养第7d时细胞数量扩增至36倍，而因子组合TP0+SCF在 培养第7d时细胞数量只扩增到29倍。所以细胞因子的有效组合、添加的剂量，都对扩增效 果起着决定性的作用。SCF不仅是干细胞扩增过程中起着重要作用的生长因子，同样对其 他细胞因子，如早期作用的ΤΡ0以及L-6、IL-11都起着协同作用，有效调控着干细胞的存 活、增殖与凋亡，这种添加细胞因子的培养方式，只是基于静态二维培养（2D)系统的优化， 表面上是可以增加细胞数量，但造血干/祖细胞的再增殖能力实际上是降低的。
[0004] 近年来，采用三维支架、生物反应器体外培养细胞成为了研究焦点，所培养的细胞 增殖情况明显优于传统的平面培养。文献报道用聚对苯二甲酸乙二酯（PET)三维支架培养 干细胞，当低密度的接种细胞时，细胞在支架上的生长状况良好，受到剪切力的损伤较小， 可得到高倍数的扩增率，细胞定向分化能力强，并保持了分化潜能。Chen等将MSCs和HSCs 共培养在旋转生物反应器（RCCS)中，第8d时达到增殖高峰，MSCs中⑶44+、⑶34_细胞增加 了 29倍和8倍，HSCs中CD34+、CD44+细胞增加9倍和29倍，到第20d，细胞数量呈下降趋 势，细胞生长周期变短，RCCS中细胞也产生了聚集现象。尽管关于细胞三维培养的研究很 多，也取得了一定的进展，但研究者选用的支架、生物反应器都各有不同，同种干细胞的培 养结果也存在着显著差异，无法考究哪一种优良的材料更适合作为三维培养的模板，以及 产业化的生产。
[0005] 完整的三维细胞培养（3D)体系需要由三部分组成，支架、种子细胞、培养系统缺 一不可。Sullenbarger等用聚酯纤维和水凝胶制备了三维支架，并将其与灌注式的生物反 应器结合，构成了一套真正意义上的能够体外生产血小板的3D体系，添加细胞因子，诱导 脐血⑶34+产生血小板。这为我们提供了思路，让构建产业化的体外生产血小板不再是一 种遥不可及的梦想。然而三维支架的研究还需要不断的探索，支架材料的多孔性、吸水性、 表面积、降解性、组织相容性、无毒性、种植率等都直接影响着细胞生长，基于这种考虑，本 实验选用了壳聚糖、明胶作为支架材料，通过浓度的不同，预温的不同，筛选构建了适合脐 血干细胞生长的三维支架，并结合RCCS系统共培养脐血⑶34+细胞体外产生血小板。实验 的成功，为探索更为安全高效的体外扩增血小板，推进血小板产业化的提供了方法，也为后 续研究中，能在此培养体系中加入基因修饰的滋养细胞，形成不用外源加入细胞因子而靠 自分泌细胞因子来产生血小板提供了基础。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血 小板分化的方法，包括以下步骤：
[0007] 1)冷冻干燥法制备不同浓度配比的壳聚糖-明胶支架，包括以下步骤：
[0008] a.称取一定量的壳聚糖和明胶；取消毒后的无菌锥形瓶一支，加入100ml的去离 子水，然后将称量的壳聚糖和明胶加入，用玻璃棒搅拌，直到看不见白色粉末；电热恒温水 浴箱加热到50°C，将盛有混合液的锥形瓶放入浸泡过夜；
[0009] b.将锥形瓶口用封口膜密封，然后用无菌包布包裹后进行高压蒸汽灭菌；待灭菌 后的壳聚糖明胶溶液冷却后，无菌注射器抽取1. 15ml冰醋酸注射到溶液内，使其终浓度为 0.2mol / L;磁力搅拌器配备的搅拌子用酒精擦拭消毒三遍；将搅拌子放入盛有壳聚糖明 胶溶液的锥形瓶内，然后置放于磁力搅拌器上，接通电源，调整频率，使壳聚糖、明胶、冰醋 酸充分混匀；
[0010] C.取12孔板，将溶液倾倒入内，每个孔的注入量不超过2 / 3体积，将12孔板盖 上孔盖，封口膜包裹，立即放置速冻冰箱内速冻15min，速冻成半固状后将12孔板再转冻存 于不同温度的低温冰箱24h，取出12孔板，将孔盖取下，平放于真空冷冻干燥机内冻干24h， 干燥后的12孔板置超净台中，通风24h，取治疗盘一个，装入0. 25%戊二醛的PBS溶液，将 治疗盘放在振摇床上，12孔板全部浸泡在溶液内，开启振摇床开关，使其室温振摇交联6h ;
[0011] d. 1%硼酸氢钠脱醛3次，每次15min，去离子水洗涤3次，每次15min，将12孔板 再次冷冻干燥，方法同步骤9-11，冷冻过夜即可，选取部分构建好的支架样本，进行切片，离 子贱射喷金，扫描电镜观察；
[0012] 2)三维培养体系诱导脐血⑶34+体外生成血小板，包括以下步骤：
[0013] a.脐血单个核细胞的分离：
[0014] b.磁性标记细胞：
[0015] ①每108个细胞在300μ 1 buffer中重悬，加入FcR阻断剂100μ 1，然后加入CD34 微珠100 μ 1标记细胞，终体积为每108个细胞500 μ 1，
[0016] ②轻轻混悬，6°C孵育，30min，
[0017] ③加入标记体积10倍量的buffer洗漆细胞，离心，lOOOrpm，lOmin，·
[0018] ④完全去除上清，每108个细胞用500 μ lbuffer重悬，
[0019] C.磁性分选
[0020] ① MS分选柱放置在MACS分选器对应的磁场中，
[0021] ②用500 μ 1 buffer充分润湿分选柱，
[0022] ③将标记好的细胞悬液匀速加入分选柱中，避免产生气泡；阴性细胞成分先行流 出，
[0023] ④用3 X 500 μ 1 buffer冲洗分选柱，3次，
[0024] ⑤将MS分选柱移出磁场，放置在空白的采集管上，
[0025] ⑥在分选柱内加入bufferlml，用MS分选柱配备的活塞加压迅速推出磁性标记细 胞，
[0026] ⑦重复上述分选步骤，用新的阳性分选柱分选洗脱出来的阳性细胞，进行二次分 选，得到纯度高的阳性细胞，加入500 μ 1 buffer将阳性细胞推出，并进行细胞计数，获得 (1. 05±0· 72) X 106 个阳性细胞。
[0027] d.支架的预处理
[0028] 刀片切割支架，支架浸泡在乙醇中溶液，PBS洗涤3次，每次5min，支架过夜浸泡在 MDM培养基中，将STLV容器全部打开，所有的组件置于超纯水中浸泡过夜；无水乙醇中浸 泡24h，组装好后进行高压蒸气灭菌，使用前在无血清培养基中浸泡过夜。
[0029] 3)三维培养体系培养
[0030] 取12孔板，每孔按照2D模式下的培养加样，接着将壳聚糖/明胶支架置孔板内， 并用无菌镊子将支架夹紧，再放松，重复此步骤5次，使更多细胞进入并粘附在支架上，置 37°C，5% C02细胞培养箱中孵育2h，再将细胞与支架移入RCCS装置的STLV培养皿内中培 养，整个装置放入5% C02细胞培养箱中，接通电源，调节转速，初始转速为15rpm，随后根据 细胞增殖状态进行调整，每3d全量更换培养液和细胞因子。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 下面结合附图和实例对本发明进一步说明，
[0032] 图1是支架扫描测试结果；
[0033] 图2是培养第3d各组支架粘附细胞情况；
[0034] 图3是扫描电镜观察支架与细胞粘附
[0035] 图4是细胞活性曲线图
[0036] 图5培养第7d流式细胞仪测定细胞⑶41、⑶61阳性表达率（a阴性对照，b2D CD41-PE+CD61-FITC+，c3D CD41-PE+CD61-FITC+)
[0037] 图6培养第14d流式细胞仪测定细胞⑶41、⑶61阳性表达率（a阴性对照，b2D CD41-PE+CD61-FITC+，c3D CD41-PE+CD61-FITC+)
[0038] 图7两种培养方式产生的血小板颗粒聚集前后的形态（瑞氏染色X 200) (a2D产 生的血小板颗粒聚集前；b3D产生的血小板颗粒聚集前；c2D产生的血小板颗粒聚集后；d3D 产生的血小板颗粒聚集后）
[0039] 图8流式细胞仪测定类血小板颗粒膜上⑶62p阳性表达率（a阴性对照， b2DCD41-PE+CD62p-FITC+，c3D CD41-PE+CD62p-FITC+)
[0040] 图9人骨髓基质细胞
[0041] 图10转染24h后人骨髓基质细胞的形态
[0042] 图11 :上面两张分别是IL-6、IL-11的阳性染色，下面分别是阴性对照（X200)
[0043] 图12Western blot检测转染人骨髓基质细胞中蛋白的表达
【具体实施方式】
[0044] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明不限于这些实施 例：
[0045] 实施例1
[0046] 配置不同浓度的壳聚糖和明胶（0. 5%，1%，1. 5% )，在不同温度条件下预冻存 (_30°C，_80°C，液氮），本实验共设计9组支架，见表1。
[0047]
【权利要求】
1. 一种构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法，包括以下步骤： 1) 冷冻干燥法制备不同浓度配比的壳聚糖-明胶支架，包括以下步骤： a. 称取一定量的壳聚糖和明胶；取消毒后的无菌锥形瓶一支，加入100ml的去离子水， 然后将称量的壳聚糖和明胶加入，用玻璃棒搅拌，直到看不见白色粉末；电热恒温水浴箱加 热到50°C，将盛有混合液的锥形瓶放入浸泡过夜； b. 将锥形瓶口用封口膜密封，然后用无菌包布包裹后进行高压蒸汽灭菌；待灭菌后 的壳聚糖明胶溶液冷却后，无菌注射器抽取1. 15ml冰醋酸注射到溶液内，使其终浓度为 0.2mol / L;磁力搅拌器配备的搅拌子用酒精擦拭消毒三遍；将搅拌子放入盛有壳聚糖明 胶溶液的锥形瓶内，然后置放于磁力搅拌器上，接通电源，调整频率，使壳聚糖、明胶、冰醋 酸充分混匀； c. 取12孔板，将溶液倾倒入内，每个孔的注入量不超过2 / 3体积，将12孔板盖上孔 盖，封口膜包裹，立即放置速冻冰箱内速冻15min，速冻成半固状后将12孔板再转冻存于不 同温度的低温冰箱24h，取出12孔板，将孔盖取下，平放于真空冷冻干燥机内冻干24h，干燥 后的12孔板置超净台中，通风24h，取治疗盘一个，装入0. 25 %戊二醛的PBS溶液，将治疗 盘放在振摇床上，12孔板全部浸泡在溶液内，开启振摇床开关，使其室温振摇交联6h ; d. 1%硼酸氢钠脱醛3次，每次15min，去离子水洗涤3次，每次15min，将12孔板再次 冷冻干燥，方法同步骤9-11，冷冻过夜即可，选取部分构建好的支架样本，进行切片，离子贱 射喷金，扫描电镜观察； 2) 三维培养体系诱导脐血⑶34+体外生成血小板，包括以下步骤： a. 脐血单个核细胞的分离： b. 磁性标记细胞： ① 每108个细胞在300 μ 1 buffer中重悬，加入FcR阻断剂100 μ 1，然后加入CD34微 珠100 μ 1标记细胞，终体积为每108个细胞500 μ 1， ② 轻轻混悬，6°C孵育，30min， ③ 加入标记体积10倍量的buffer洗漆细胞，离心，lOOOrpm，lOmin， ④ 完全去除上清，每1〇8个细胞用500 μ 1 buffer重悬， C.磁性分选 ① MS分选柱放置在MACS分选器对应的磁场中， ② 用500 μ 1 buffer充分润湿分选柱， ③ 将标记好的细胞悬液匀速加入分选柱中，避免产生气泡；阴性细胞成分先行流出， ④ 用3 X 500 μ lbuffer冲洗分选柱，3次， ⑤ 将MS分选柱移出磁场，放置在空白的采集管上， ⑥ 在分选柱内加入bufferlml，用MS分选柱配备的活塞加压迅速推出磁性标记细胞， ⑦ 重复上述分选步骤，用新的阳性分选柱分选洗脱出来的阳性细胞，进行二次分选， 得到纯度高的阳性细胞，加入500 μ 1 buffer将阳性细胞推出，并进行细胞计数，获得 (1. 05+0. 72) X 106 个阳性细胞； d.支架的预处理 刀片切割支架，支架浸泡在乙醇中溶液，PBS洗涤3次，每次5min，支架过夜浸泡在 MDM培养基中，将STLV容器全部打开，所有的组件置于超纯水中浸泡过夜；无水乙醇中浸 泡24h，组装好后进行高压蒸气灭菌，使用前在无血清培养基中浸泡过夜； 3)三维培养体系培养 取12孔板，每孔按照2D模式下的培养加样，接着将壳聚糖/明胶支架置孔板内，并用 无菌镊子将支架夹紧，再放松，重复此步骤5次，使更多细胞进入并粘附在支架上，置37°C， 5% C02细胞培养箱中孵育2h，再将细胞与支架移入RCCS装置的STLV培养皿内中培养，整 个装置放入5% C02细胞培养箱中，接通电源，调节转速，初始转速为15rpm，随后根据细胞 增殖状态进行调整，每3d全量更换培养液和细胞因子。
2. 如权利要求1所述的构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法，其 特征在于：脐血单个核细胞的分离方法包括以下步骤：取容积100ml的玻璃瓶，高压灭菌消 毒，将除皮后的抗凝脐血管端酒精消毒，无菌剪刀剪开，然后将血液加入玻璃瓶中；以体积 比1 : 1的比例加入RPMI-1640培养基，混匀，计混合液量，每支离心管中加入Ficoll淋 巴分离液4ml，用吸管吸取脐血细胞混合液6ml置离心管，必须缓慢沿管壁加入，水平离心 机离心，2200rpm，45min，离心后可见分层清晰，细胞在下层，分离液在中间层，血菜；、PBS和 血小板在上层，上层与中层间有一层明显的白色云雾状，即为单个核细胞层，用吸管小心吸 出，尽量吸取完整，转入新的空离心管中，取新离心管一只，加入单个核细胞液lml，再加入 5ml PBS液，离心，lOOOrpm，lOmin，弃上清，重复步骤8洗漆细胞一次，离心后弃上清，见管 底有少量残留红细胞，加入RPMI-1640培养基lml混悬细胞，再加入氯化铵溶血素5ml，比例 为1 : 5,混匀，室温放置lOmin，离心，1000rpm，10min，弃上清，PBS洗涤一遍，洗掉红细胞 裂解液，加入bufferlOml，充分混悬细胞，用400目细胞滤网过滤细胞，收集细胞并离心，力口 入bufferlOml，取出标本10μ 1，5倍稀释计数，获得（1. 32±0. 16) X108个细胞，其余标本 离心，lOOOrpm，lOmin，弃上清，备用。
3. 如权利要求1所述的构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法，其特 征在于：2D模式下的培养加样为：用12孔培养板作细胞培养，每孔5X10 4 / ml CD34+细胞， 培养基为頂DM，并加入细胞因子SCF50y l、rhTP030y 1、IL-630y 1和IL-ΙΗΟμ 1，体积为 2ml /孔，置37°C，5% C02细胞培养箱中培养，每3d全量更换培养液及其细胞因子。
4. 如权利要求1所述的构建三维培养体系诱导脐血干细胞向血小板分化的方法，还可 以将有关细胞因子基因转染到骨髓基质细胞内，并将其作为滋养细胞，共同构建三维培养 体系； (1)表达载体的构建 1. 1引物设计合成及cDNA的扩增 据GenBank上BMP序列，应用Primer Prim6. 0软件设计，由 Invitrogen Biotechnology Co. LTD 中国公司合成 PCR 引物；TP0 正引物：5_' CGGAAGCTTAATTGAGGCGCCCATTTCAGAAG -3'，反引物：5'-GCGCTGCAGGAGGGCTCTCGGCAGCCTGTG-3' ；IL-6 正引物：5'-AAGCTTGAGAA GCTCTATCTCCCCTCC-3'，反引物：5'-GGATCCGTGCCCATGCTACATTTGCCG-3' ；IL-11 正引物： 5' -GGATCCGCGGAC AGGGAAGGGTTAAAG-3'，反引物：5' -AAGCTTTCACAGCCGAGTCTTCAGCAG-3' ； 总RNA抽提取按照Trizol总RNA提取试剂盒说明书操作，按80mg组织/ ml Trizol加入 Trizol并匀浆，分别在人胎肝细胞、人T细胞、人肝癌继代细胞中提取TPO、IL-6、IL-11的 总RNA ;根按文献[9方法]操作，逆转录制备cDNA，聚合酶链反应扩增产物，将产物行1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收，分别获得人TPO、IL-6及IL-11片断； 1. 2质粒的酶切及连接 TPO 和 pEGFP-Nl 载体用 EcoRI 和 Hind I II 双酶切、IL-6 和 pcDNA3. 1 (+)载体用 BamH I和Hind III双酶切、IL-11和pcDNA3. 1 (-)载体用BamH I和Hind III双酶切，分别用 T4DNA连接酶进行连接，取连接产物转化至感受态细胞DH5 α ;经过菌落PCR鉴定，质粒抽提 TPO-pEGFP-Nl、IL-6-pcDNA3. 1(+)及 IL-ll-pcDNA3. 1(_)后经酶切鉴定及基因测序验证， 构建表达载体成功； (2) 骨髓基质细胞的分离及培养取无菌操作抽取并用肝素抗凝的人新鲜骨髓血10ml， 转入超级洁净工作台内，加入O.Olmol / 1 PBSlOml，轻轻混匀，水平静置；沉降红细胞 30min后，待底部红细胞层与上清有明显的分界，轻轻吸取上清液，转入15ml的离心管中， 1000g离心5min，离心后弃上清，并加入5ml生理盐水，混匀；缓慢将细胞悬液加入预先装有 5ml淋巴细胞分离液的15ml离心管中，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层；1500g离心 25min，离心后溶液分层，轻轻吸取中间的骨髓基质细胞层，用盐水洗涤3次 [1°] ;1000g离心 1〇11^11，弃上清，用含有15%胎牛血清的01^1以106/1111细胞浓度接种于25(^培养瓶中， 在37°C、5% 0)2培养箱中培养；2、5及8d后半量换液，待12d后细胞长至融合时以胰酶消 化传代，以第3代细胞做为转基因的靶细胞； (3) 人骨髓基质细胞的转染1)转染前24h，用0.25%胰蛋白酶消化人骨髓基质细胞， 收集并计数，以1X105 / ml接种于6孔培养板中，在37°C、5% C02孵箱中培养，使细胞转 染时融合度达90%?95% ;2)转染前2h给细胞换液；3)转染前将6孔培养板中细胞用 0PTI-MEM培养基轻轻冲洗2次，倒掉废液，再加入2ml 0PTI-MEM培养基，备用；3)按照试剂 盒说明书要求配制转染液：1液由0PTI-MEM240 μ 1加混合质粒4 μ 1 (前期预实验时确定转 染质粒TPO、IL-6、IL-11的比例为3 : 3 : 4,混合质粒按4μ 1配制混匀）配制；II液由 240 μ 1加脂质体4 μ 1配制；4)将总体积为500 μ 1的I液和II液混合，轻轻摇匀，室温静 置20min5)弃6孔培养板中的0ΡΤΙ-ΜΕΜ培养基，并向培养板中加入上述混合物，放入37°C、 5%0) 2培养箱中培养；6)转染611后，细胞换液，加入含10(%胎牛血清的01^1培养基21111/ 孔，于37°C、5% C02培养箱中继续培养；7)按常规脂质体转染法转染空载体，作为多质粒传 染的对照； (4) 人骨髓基质细胞的筛选及传代1)转染细胞培养24h后，按105 / ml /孔接种于 24孔板中，将每孔中的G418浓度分别稀释至0、100、200、300、400、500、600、700、800、900和 lOOOnmol / L的终浓度，加入各孔中，观察细胞的生长状况，以d8细胞全部死亡的最低浓 度50011111〇1/1^为6418的筛选浓度 ；2)细胞转染后换含20(%血清的01^1培养液继续培养 48h，胰蛋白酶消化，将细胞以1 : 6传代；3)转染细胞传代后换含500nmol / L G418的骨 髓基质细胞培养液常规培养、筛选，定期更换培养液，在正常细胞7d死亡后，继续对转染细 胞筛选1周，镜下可见存活细胞克隆； (5) 转染后的应用：分别成功构建了 3个不同质粒，然后将3个不同质粒同时转染到基 质细胞中；各质粒DNA之间质量的比例是决定转染效率的关键因素，通过预试验不断调整 质粒DNA的比例，最终确定TP0、IL-6和IL-11的比例为3 : 3 : 4时能获得较高的转染效 率；正是通过如此选择和调整，最终提高了多质粒共转染的效率；转染细胞的TPO、IL-6和 IL-11这3个细胞生长因子表达量均升高，没有出现单个生长因子表达量特别高或特别低。
【文档编号】C08L5/08GK104152410SQ201410067679
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】赵树铭, 王世春, 王甜甜 申请人:赵树铭