有5 mL不完全培养液的平皿中，取一铜网，将脾脏置于铜网上，用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内的不完全培养液冲洗铜网，使脾细胞全部通过网孔进入溶液中。将脾细胞溶液转入50 ml离心管中，加不完全培养液至30 mL，混匀。1000 rpm离心5 min，弃上清。沉淀细胞再用不完全培养液离心一次，然后将细胞悬于10 ml完全培养液中，混匀。细胞计数，备用。
[0022]将骨髓瘤细胞与脾细胞按1: 10的比例混合，在50 mL离心管中用DMEM培养基洗I次，1200 rpm离心8 min ;弃上清，用吸管吸净残留液体。用50%PEG融合，用含20%牛血清、1% HAT DMEM培养基重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100 μ L。将培养板置37°C、5%C02培养箱中培养。DMEM培养基为含有2% (重量百分数)生长因子的DMEM基础培养基，DMEM基础培养基购于Hyclone公司，1%HAT (次黄嘌呤一氨基蝶呤一胸腺啼啶核苷购于Gibco公司。
[0023]3.细胞株的筛选及克隆
待细胞融合后第10天左右，细胞集落长到占孔底1/2面积大小，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素BI而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素BI作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为O的孔即阴性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC 50值较小)，采用有限稀释法将杂交瘤细胞克隆化，克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2次后，获得杂交瘤细胞株AFB1-2A4。
[0024]实施例2:抗体的制备、纯化及鉴定
将实施例1获得的将获得的杂交瘤细胞株AFB1-2A4注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗黄曲霉毒素BI的单克隆抗体。
[0025]具体操作为:腹水于4°C 3000r/min离心5min以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 yL，室温混合30min，4°C静置2h，使其充分沉淀。然后4°C 12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入1/10滤液体积的0.lmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，4 °C预冷I小时，缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%，4°C静置2h，4°C 12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置_20°C冰箱中备用；
醋酸盐缓冲液:0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至10mL ；
0.lmol/L磷酸盐缓冲液:0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，
0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL。
[0026]0.01mol/L磷酸盐缓冲液:用纯水将0.1 mol/L磷酸盐缓冲液稀释10倍。
[0027]用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得2A4的鼠腹水抗体的效价可达3.12X106，即腹水稀释至3.12X106时测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素BI的半抑制浓度IC50为33.2 pg/mL，与黄曲霉毒素B2的交叉反应率2.3%，与黄曲霉毒素Gl的交叉反应率9.9%，与黄曲霉毒素G2的交叉反应率0.5%，与黄曲霉毒素Ml的交叉反应率1.6%。
[0028]实施例3:抗体的应用
将杂交瘤细胞株AFB1-2A4分泌的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体用于黄曲霉毒素BI单克隆ELISA添加回收试验，具体步骤如下:
(I)包被:使用96孔聚苯乙烯酶标板，用0.05mol/L pH 9.6的碳酸缓冲液将AFBl-BSA稀释到I μ g/mL,用多道可调式移液枪(简称排枪)往每孔中加入100 μ L，加完后将酶标板用保鲜膜盖住，置于4°C过夜。
[0029](2)洗板:第二天，将酶标板从4°C取出，使用PBST洗涤，每孔250 μ 1，洗涤4次，洗完后在毛巾上拍干。
[0030](3)封闭:用排枪往每孔中加入200 μ L 1% BSA的PBS，加完后将酶标板用盖盖住，置于37°C放置2h。使用PBST洗涤，每孔250 μ 1，洗涤4次，洗完后在毛巾上拍干。
[0031](4)用 10% 甲醇配制 0、0.005、0.015、0.045、0.14,0.41 μ g/L 的黄曲霉毒素 BI 标准溶液。将标准溶液及待检测样品提取液，分别加入已经封闭好的酶标板中，50mL/孔，每个样品3个重复孔，再加入稀释成1:160000黄曲霉毒素BI单克隆抗体50mL/孔，加入稀释成I:4000酶标二抗50mL/孔，轻轻拍打酶标板后37°C恒温箱中反应40min。
[0032](5)洗板:操作同上。
[0033](6)显色:将显色液A和显色液B按1:1的体积比混合，用排枪加入混合好的显色液10mL/孔，置37°C恒温箱避光环境反应lOmin。
[0034](7)测定:使用排枪加入2mol/L H2SO4 50mL/孔，轻轻振荡酶标板，使用酶标仪检测450/630nm波长处OD值。
[0035](8)添加回收率及样品前处理:称取5g样品置于干净的50mL离心管中，分别添加l、4、16ng AFBl，加入25mL样品提取液，盖上盖后振荡5min，4000转离心5min，取上清50mL，加入950mL样品稀释液，混匀后作为ELISA样品提取液待测。采用直接竞争ELISA进行添加回收率实验，回收率分别为82.4、102.3,95.7%。
[0036](9)溶液的配置:碳酸缓冲液:称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加入纯水至990mL，调pH至9.6，再用纯水定容至lOOOmL，4°C贮存备用。磷酸缓冲液(PBS): 8.5gNaCl, 2.2g Na2HPO412H20，0.2g NaH2P042H20，溶于 900mL纯水中，调pH至7.4，定容至 lOOOmL。PBST:取500mL PBS，加入0.25mL吐温20，混匀备用。
[0037]显色液A:20mg TMB溶于1mL DMSO中，4°C保存，临用前取出恢复至室温，用纯水稀释至100mL。
[0038]显色液B:21g —水合柠檬酸，71.1g Na2HP0412H20，2g过氧化氢尿素，加纯水定容至 10OOmT,η
[0039]样品提取液:取4g NaCl，溶于30mL水中，再加入70mL甲醇，混匀待用。
[0040]酶标二抗购自于SoutherB1tech公司。
【主权项】
1.杂交瘤细胞株AFB1-2A4，其特征在于:已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC N0.10200。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株AFB1-2A4分泌的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体，其特征在于:它由所述的杂交瘤细胞株AFB1-2A4所分泌产生。
3.权利要求2所述的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体的应用，其特征在于在黄曲霉毒素BI分析检测中的应用，对黄曲霉毒素BI具有较好的亲和力和检测灵敏度，用于食品安全中黄曲霉毒素BI免疫检测。
【专利摘要】本发明提供了杂交瘤细胞株2A4、其分泌产生的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株2A4可以用于制备高效价黄曲霉毒素抗体，鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA) 法测得的效价可达 3.12×106；该抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体灵敏度高，对黄曲霉毒素B1的 50％抑制浓度即 IC50为33.2pg/mL，其用于测定黄曲霉毒素B1含量，实际应用价值大。CGMCC No.1020020141212
【IPC分类】C07K16-44, G01N33-577, C12R1-91, C12N5-20
【公开号】CN104762267
【申请号】CN201510019717
【发明人】时国庆, 孙清, 邓乾民
【申请人】北京科技大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年1月15日