的0PSS酶。
[0031] 基于甚至在额外的酶不存在的情况下，缺失五个C-末端氨基酸残基的源自结核 分枝杆菌H37RV的0PSS突变体对含S 2,团的硫源显示出增加的亲和力的报道，0PSS突变 体可通过缺失耻垢分枝杆菌0PSS的五个C-末端氨基酸残基来制备。本发明的0PSS突变 体可具有源自耻垢分枝杆菌的对应于SEQ ID N0 :1的氨基酸序列，其缺失三至七个，优选五 个C-末端氨基酸残基。
[0032] 在本发明的一个实施方案中，观察到具有SEQ ID N0 :2氨基酸序列突变被用于转 化0PS为半胱氨酸后，显示出一小时内100%的转化率（表5)。
[0033] 氨基酸替换可进一步提高本发明0PSS突变体酶的活性。只要是本领域已知的，任 何方法均可可用于改进酶。优选地，在本发明中，采用随机突变提高OPSS突变体酶的活性。 具体地，0PSS进行随机突变后，本发明人利用基于HTS (高通量筛选）开发出的筛选系统筛 选出酶活性提高的突变体。结果是，通过对Msm-T基因进行HTS筛选获得具有酶活性提高 的0PSS突变体、Msm-T HA2和Msm-T-EP3〇Msm-T HA2是具有与SEQ ID N0:2相同的氨基酸 序列的0PSS突变体，除了 77位的脯氨酸残基（Pro)被丝氨酸残基（Ser)取代。Msm-T-EP3 是具有与SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列的OPSS突变体，除了以下位置发生突变：131位 苏氨酸被丙氨酸残基（Ala)取代，137位天冬酰胺残基（Asp)被赖氨酸残基（Lys)取代，以 及238位苏氨酸残基（Thr)被丝氨酸残基（Ser)取代。优选地，OPSS突变体Msm-T HA2和 Msm-T EP3分别具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列。
[0034] 在本发明的一个实施方案中，发现Msm-T HA2和Msm-T EP3比具有SEQ ID N0:2 氨基酸序列的Msm-T显示出更高的酶活性（表5和6)。具体地，测出OPSS突变体Msm-T HA2和Msm-T EP3相比对照Msm-T，在转化反应早期显示出提高5倍和1. 2倍的转化率。此 外，甚至当Msm-T HA2突变体的半胱氨酸合成活性比Msm-T酶高4倍，且其用量是Msm-T的 40 %时，半胱氨酸的终转化率是相似的。
[0035] 如本文所使用，术语"同源性"是指两个多肽之间的相似百分数。一条序列另一条 序列之间的相关性可采用本领域已知的技术确定。例如，同源性的确定可通过序列信息的 比对和使用现成的计算机程序，直接比较两条多肽分子之间的序列信息。或者，同源性的确 定可通过在使同源区之间形成稳定双链的条件下进行多核苷酸杂交，然后用特异性单链核 酸酶消化并测定酶切片段的大小。
[0036] 如本文所使用，所有语法形式和拼写变化形式的术语"同源的"，是指具有共同进 化起源"的蛋白之间关系，包括超家族蛋白（如免疫球蛋白超家族）和来自不同物种的同源 蛋白（例如，肌球蛋白轻链等）。这些蛋白（及它们的编码基因）具有如由它们的序列相似 性反映出的序列同源性。然而，在常见的用法和本发明的应用中，术语"同源的"在被副词 如"高度地"修改时，可以指序列的相似性，其可能会或可能不会涉及到共同的进化起源。
[0037] 如本文所使用，所有语法形式的术语"序列相似性"，是指可能会或可能不会拥有 共同的进化起源的核酸或蛋白的氨基酸序列之间的相似度或相关性。在一个具体实施方案 中，当至少21%(优选至少约50%，更优选约75%、90%、95%、96%、97%或99%)的氨 基酸序列与氨基酸序列的确定长度匹配时，两个氨基酸序列是"大体同源"或"大体相似" 的。大体同源的序列可利用标准软件通过在序列数据库中比较序列，或在例如为该特定系 统定义的严格条件下进行Southern杂交实验来确定。定义的杂交条件在本领域范围内（如 Sambrook 等人，1989,见下）。
[0038] 本发明的0PSS突变体可催化巯基（SH基团）转移至0PS上以生产半胱氨酸。 优选地，所述条件允许本发明的0PSS突变体发挥它们的最佳活性，包括：i)存在0-2mM PLP(5'_磷酸吡哆醛）或0-100mM DTT (二硫苏糖醇）作为辅因子，ii)25~60°C的反应温 度，以及iii)pH6. 0~10. 0,但不仅限于此。
[0039] 通过将巯基基团转移到0PS底物上从而催化半胱氨酸合成的酶活性的测定与 Ape-〇PSS(〇-磷酸丝氨酸巯解酶）的命名一起被公开。特别是，由于Ape-OPSS具有通 过转移巯基基团使0AS转化成半胱氨酸的活性，该检测是基于对大肠杆菌半胱氨酸合 成酶的测定（0ASS，0-乙酰丝氨酸巯解酶，EC 4. 2. 99. 8)) (Mino K和Ishikawa K，FEBS letters,551:133-138, 2003)。
[0040] 在本发明的一个实施方案的试验中，PLP为OAS (0-乙酰丝氨酸）或OPS提供巯基 基团，其在半胱氨酸转化中作为0ASS或0PSS的辅因子，添加浓度为0. 2mM。此外，由于其还 原能力，加入DTT不仅可以防止暴露于空气的半胱氨酸的半胱氨酸氧化，而且还可以定量 已经氧化的半胱氨酸的量。优选地，当加入25mM DTT或0. 2mM PLP时，半胱氨酸的转化率 增加2. 3倍。也就是说，PLP和DTT对0PS转化成半胱氨酸具有正面的影响。
[0041] 如之前报道的，酶Ape-OPSS、Mtb-OPSS和Mtb-T的最佳反应温度是60°C或37°C， 最适 pH 为 7.4(Mino K 和 Ishikawa K，FEBS letters，551:133-138,2003;Agren D，Schnell R和Schneider G, FEBS letters, 583:330-336, 2009)。基于该报道，具有提高的酶活性的 0PSS突变体的转化反应条件可以得到优化。
[0042] 在本发明的一个实施方案中，0PSS突变体可在37°C~80°C下催化转化。具体地， 可在高温下生长的来自古细菌（Archea spp.)的Ape-〇PSS酶，在60°C下比在37°C下显示出 更高的酶活性。此外，酶本身的高热稳定性使得最佳温度为60°C。另一方面，Msm-T在37°C 下显示出最佳酶活性，且不能耐受60°C下的热处理。据发现0PSS酶在pH值6. 0~10. 0下 保持转化活性。检测到Ape-〇PSS在pH7. 4显示出最佳酶活性，Msm-T在pH8. 0~9. 0显示 出最佳酶活性。因此，Msm-T比Ape-OPSS具有更广泛的pH稳定范围。
[0043] 根据其另一个方面，本发明提供一种编码0PSS突变体的核酸分子。
[0044] 如本文所使用，术语"核酸分子"旨在包含DNA和RNA分子。构成核酸分子结构 单元的核苷酸，不仅包括天然存在的核苷酸，而且包括糖部分或碱性部分修饰的类似物 (Scheit,核苷酸类似物（Nucleotide Analogs)，John Wiley,纽约（New York) (1980); Uhlman 和 Peyman,化学综述（Chemical Reviews) ,90:543-584 (1990))。
[0045] 根据其又一个方面，本发明提供含有所述核酸分子的表达载体。
[0046]"载体"是指任何用于克隆核酸和/或将核酸转移到宿主细胞中的载体。载体可以 是连有另一个DNA片段的复制子，从而使所连接的片段得到复制。"复制子"是指任何能够在 体内具有DNA复制自主单元功能，即能够在自身控制下进行复制的遗传元件（如质粒、B莖菌 体、粘粒、染色体、病毒）。术语"载体"包括用于将核酸在体外、胞外或体内引入宿主细胞中 的病毒和非病毒性的载体。术语"载体"，也可包括微环DNA。例如，载体可以是不含细菌DNA 序列的质粒。已证明富含CpG区的细菌DNA序列的去除可降低转基因表达沉默，并形成质粒 DNA 载体的持续表达（见例如，Ehrhardt，A?等，（2003)Hum Gene Ther 10:215_25;Yet，N. S. (2002)M〇I Ther 5:731-38 ;Chen，Z.Y?等，（2004)Gene Ther 11:856-64)。术语"载体"也 可包括转座子如睡美人（Sle印ing Beauty) (Izsvak 等，J. Mol. Biol. 302:93-102 (2000))， 或人工染色体。
[0047] 作为载体，使用17启动子的pET系统（Novagen公司）是本领域众所周知的。在 本发明中，可毫无限制的使用本领域已知的各种表达系统。
[0048] 在本发明的一个实施方案中，由本发明人开发的使用CJ1启动子的表达系统用于 表达外源基因（见韩国专利公开号No. 10-2006-0068505,图7)。
[0049] 在本发明的一个实施方案中，在相同条件下比较含17启动子的pET系统和含CJ1 启动子的CJ1系统之间0PSS的表达水平。结果是，CJ1系统比pET系统显示出更高的0PSS 表达水平（图3)。此外，在pET系统中过表达0PSS需要低温（18°C)和较长时间，而在CJ1 系统中需要高温（37°C )和较短时间。因此，优选使用CJ1启动子来有效获得OPSS，但本发 明不限于此。
[0050] 根据其进一步的方面，本发明提供用所述表达载体转化的转化体。
[0051] 如本文所使用，所有语法形式和拼写变化形式的术语"转化"是指由向宿主细胞中 引入外源基因，使所引入的基因能够自主复制或作为整合至染色体中的因子所带来的人工 遗传改变。
[0052] 可采用本领域已知的合适的标准技术将本发明的载体导入宿主细胞，实例包括但 不限于电穿孔。磷酸钙共沉淀法、逆转录病毒感染、显微注射、DEAE-葡聚糖