稻曲菌pcr检测引物及其用图
【专利摘要】本发明公开了一组稻曲菌PCR检测引物，本发明通过比较基因组的方法寻找到稻曲菌的特异性检测靶标，并设计检测引物。这与传统的稻曲菌PCR检测引物相比具有特异好、稳定性强和灵敏度高的优点，在检测过程中很好地控制了假阳性的出现，同时又可以精确检测到稻曲菌的存在，为稻曲菌的田间检测、稻曲病病害循环研究以及该病害的预测等提供了很好的工具。
【专利说明】
稻曲菌PCR检测引物及其用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及稻曲菌PCR检测引物及其用途。
【背景技术】
[0002] 稻曲病（Rice false smut)是由Ustilaginoidea virens引起的一种重要的水稻 真菌病害，在全球各稻区均有发生。近些年，随着水稻栽培模式的改变，稻田氮肥施用量的 增加，加上新型高产密穗型杂交稻的大面积推广，稻曲病已逐步上升为水稻的主要病害。稻 曲病的大面积发生不仅影响水稻产量和品质，稻曲球中产生的稻曲菌素对人畜有毒害作 用，严重影响粮食安全。
[0003] 目前研究认为，稻曲菌以厚垣孢子和菌核在土壤或病残体中越冬，萌发形成分生 孢子或子囊孢子，在水稻孕穗末期侵染小穗和花丝，最后在水稻谷粒上形成绿色的稻曲球。 基于稻曲菌特殊的侵染过程，在病害发生前期进行PCR检测对深入了解稻曲菌的侵染机制 以及稻曲病的田间预测尤为重要。先前报道的稻曲菌特异性检测引物都是基于稻曲菌的 ITS区域(rDNA internal transcribed spacer)设计，而一些近缘种真菌之间的ITS区域有 着较高的同源性，比如核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum)和灰葡萄孢（Botrytis cinerea)的ITS区域有着高达99%的同源性，稻曲菌和一些麦角菌科的真菌的ITS区域也有 高达85%的同源性，导致这些引物检测的特异性显著降低。因此，寻找稻曲菌新的特异性检 测靶标显得尤为重要。
[0004] 生物信息学以及测序技术的发展为寻找稻曲菌特异性检测靶标提供了新的思路。 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是一种比较DNA序列之间的差异的程序，通 过BLAST比对，可以进行基因组间的比较，筛选出稻曲菌种内特异性基因作为检测靶标。随 着高通量测序技术的高速发展，微生物全基因组测序的成本和时间大大降低。目前，包括稻 曲菌在内的许多物种的全基因组被测序，为筛选稻曲菌特异性检测靶标提供了数据支持。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服传统稻曲菌PCR特异性检测靶标单一，检测引物特异性不 强的缺陷，提供一种具有强特异性和高灵敏度的稻曲菌特异性巢式PCR检测引物，本发明还 提供了该引物的用途。
[0006] 为了达到以上目的，本发明采取以下技术措施：
[0007] 稻曲菌特异性检测靶标筛选及引物设计：
[0008] 用AUGUSTUS软件（Version 2·5·5)(http://augustus·gobies·de/)对稻曲菌基因 组进行基因预测，得到8231个基因的DNA序列和蛋白序列。构建了一个包含43个物种预测基 因的数据库。用BLASTP程序将稻曲菌预测基因的蛋白序列与构建的43个物种的预测基因进 行第一轮比对，筛选得到110个稻曲菌的特异性基因。再用BLASTP程序将这110个基因与 NCBI的NR数据库进行第二轮比对，筛选得到96个稻曲菌的特异性基因。从最终筛选得到的 96个稻曲菌特异基因中随机选取20个基因，并以此为靶标依据其DNA序列设计巢式PCR检测 引物。
[0009]稻曲菌特异性巢式PCR检测引物稳定性、特异性和灵敏度的验证：
[0010]为了验证靶标及引物的稳定性，用所设计的引物对97个分离自全国不同省份的稻 曲菌菌株DNA进行扩增，发现有19个靶标基因都能扩增得到，而有一个编号为G192的基因只 能在16个湖北和4个陕西的菌株上扩增到，故舍弃这个靶标基因。选取其余19个靶标基因及 其对应引物进行特异性验证。用19对巢式PCR引物对收集到的16个病原真菌、2个病原细菌 以及2个品种的水稻DNA进行PCR扩增，结果显示均无法扩增到相应目的条带，说明这些引物 具有较强的特异性。将稻曲菌DNA进行浓度梯度稀释，用19对巢式PCR检测引物分别进行扩 增，结果显示编号为Uv-1F/U v-1R、UV-2F/Uv-2R的巢式PCR引物可以检测到最低浓度为lfg/ μL的稻曲菌DNA。
[0011] 稻曲菌特异性巢式PCR检测引物的应用：
[0012] 为了验证该巢式PCR检测引物在具有高背景的混合DNA样品中依然可以准确检测 到稻曲菌DNA，用稻曲菌的菌丝孢子混合液以PSB培养基为对照在水稻孕穗7-8期对穗包进 行注射接种。保湿培养2天后，取接种水稻穗部提取DNA进行PCR检测，发现接种了稻曲菌的 穗子都可以检测到稻曲菌的存在，对照均扩增不到目的片段。说明该检测引物可以在混合 DNA样品中检测到稻曲菌的DNA。
[0013] 同时在田间对孕穗期的水稻进行随机取样，将水稻分为根、茎、叶和穗分别进行 DNA提取和PCR检测，发现根、茎、叶和穗都可以检测到稻曲菌的存在。说明该引物可以用于 田间检测。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0015] 1.通过比较基因组的方法寻找到稻曲菌的特异性检测靶标，并设计检测引物。这 与传统的稻曲菌PCR检测引物相比具有特异好、稳定性强和灵敏度高的优点，在检测过程中 很好地控制了假阳性的出现，同时又可以精确检测到稻曲菌的存在，从而为稻曲菌的田间 检测、稻曲病病害循环研究以及该病害的预测等提供了很好的工具。
[0016] 2.提供了一种方便、高效的病原菌特异性PCR检测靶标筛选的方案，只需要获得目 标病原菌的全基因组或部分基因组序列就能完成靶标筛选，有效地解决了检测靶标单一、 设计的检测引物特异性不强的问题。
【附图说明】
[0017] 图1引物Uv-1F/Uv-1R、UV-2F/Uv-2R的稳定性检测胶图，其中泳道1-9:采自吉林省 的稻曲菌菌株，10-19:采自辽宁省的稻曲菌菌株，20-23:采自陕西省的稻曲菌菌株，24-27: 采自河南省的稻曲菌菌株，28-42:采自湖北省的稻曲菌菌株，43-51:采自湖南省的稻曲菌 菌株，52-59:采自江西省的稻曲菌菌株，60-71:采自浙江省的稻曲菌菌株，72-82:采自福建 省的稻曲菌菌株，83-95:采自广西省的稻曲菌菌株，96:采自广东省的稻曲菌菌株，M: DL500Marker。
[0018] 图2引物Uv-lF/Uv-lR，Uv-2F/Uv-2R的特异性检测胶图，其中泳道1-22: Ustilaginoides virens、Botrytis cinerea、Leptosphaeria biglobosa、Sclerotinia minornSclerotinia trifoliorum、Sclerotinia nivalis、Sclerotinia sclerotiorum、 Rhizoctonia solani、Coniothyrium mini tans、Colletotrichum higginsianum、 Beauveria bassiana、Magnaporthe oryzae、Alternaria arborescens、Alternaria alternata、Phoma enqua、Trichoderma Koningiopsis、Metarhizium anisopliae、 Ralstonia solanacearum、Xanthomonas oryzae、7Kf__^_98、7Kf^IR28、CK，M: DLlOOOMarker。
[0019] 图3引物Uv-lF/Uv-lR，Uv-2F/Uv-2R的灵敏度检测胶图，其中泳道M:DL1000 Marker;l_9:10即/^1、1即/^1、100卩区/^1、10卩区/^1、1卩区/^1、1001^/^1、101^/^1、11^/^1的稻 曲菌DNA。
[0020] 图4引物Uv-IF/Uv-IR，UV-2F/UV-2R检测接种2天后稻穗，其中泳道1-3:随机选取 的3个接种稻曲菌的稻穗检测结果，泳道4-6:随机选取3个对照稻穗检测结果，泳道7:阳性 对照，泳道8:阴性对照。
[0021] 图5引物Uv-lF/Uv-lR，Uv-2F/Uv-2R检测田间水稻根、茎、叶和穗，其中1-5为水稻 样品植株编号，M:100bp DNA ladder。
【具体实施方式】
[0022]本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或材料， 如未特别说明均为公众可获得的。
[0023] 实施例1
[0024] 1.稻曲菌全基因组预测、特异性检测靶标筛选及引物设计
[0025] 1.1稻曲菌全基因组预测
[0026] 依据测序获得的稻曲菌测序菌株HWD-2基因组(Jia et al. ,2015)，用AUGUSTUS (Version 2.5.5)软件以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum)基因组为参考模型进行稻曲 菌基因的预测。最终预测分析稻曲菌含有8231个基因，并获得相应DNA序列和蛋白序列。
[0027] 1.2比对所用本地数据库的构建及稻曲菌特异性靶标基因的筛选
[0028] 为了减少计算机的运算量，降低对计算机的配置要求以及节约时间，采用两个数 据库，一个是包含43个物种预测蛋白序列的数据库（表1)，另一个是NCBI的NR数据库，以 BLASTP(version 2.2.28+)进行两轮比对。由于NR数据库包含了现有绝大部分测序物种的 基因数据，数据量非常大，比对起来很耗费时间，所以先用一个小的本地数据库筛选出去一 部分同源序列，再与NR数据库进行比对，筛选得到特异性序列。
[0029] 从各个数据库中下载43个物种预测蛋白序列构建本地数据库(表1)。由于检测病 原菌的寄主是水稻，所以其中包含有水稻的预测蛋白序列以排除假阳性的影响;数据库中 还包含了稻痕菌(Magnaporthe oryzae)和白叶枯菌(Xanthomonas oryzae)的蛋白序列，意 在排除这两种常见水稻病原菌造成假阳性的影响；数据库中还有如镰刀菌（Fusarium graminearum，Fusarium oxysporum)和黑粉菌（Ustilago maydis)等与稻曲菌亲缘关系较 近的菌，旨在为了最大限度筛选稻曲菌的特异性基因。数据库中其它的菌基本都是一些常 见或者分布广泛的物种。将稻曲菌预测的蛋白序列与这个本地数据库用BLASTP进行比对， 设e值为1E-5,大于1E-5的序列则认为不具有同源性。选取比对后e值大于1E-5的稻曲菌蛋 白序列作为第一轮筛选结果。BLASTP输出的比对结果数据用PERL语句(www. uoguelph. ca/_ thsiang/est/)进行提取。最终通过第一轮的比对获得110个特异性基因。将这110个特异性 基因的蛋白序列用BLASTP程序与NCBI的NR数据库进行比对，设e值为1E-5,选取e值大于1E- 5的稻曲菌蛋白序列，用PERL语句进行提取。最终获得96个稻曲菌特异性基因的蛋白序列， 根据相应编号找到对应的DNA序列，随机选取20个特异性基因作为候选检测靶标进行引物 设计。
[0030]表1 43个物种和相应预测蛋白序列及来源
[0034] 1.3特异性PCR检测引物设计
[0035] 从基因组中提取出候选的20个候选革巴标的序列。用Oligo 7(Molecular Biology Insights，Inc，Cascade，CO，USA)软件进行引物设计，采用巢式PCR的方法，设计嵌套式引 物。本实验所用引物均由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。
[0036] 2.稻曲菌特异性检测引物稳定性、特异性和灵敏度的筛选
[0037]收集97个全国各地的稻曲菌菌株，分别提取DNA，用20对巢式PCR引物进行扩增，结 果显示有19个靶标基因都能扩增得到，说明这19个靶标基因都能在97个稻曲菌菌株都存 在，具有较好地稳定性。而有一个编号为G192的基因只能在16个湖北和4个陕西的菌株上扩 增到，故舍弃这个靶标基因。选取其余19个靶标基因及其对应引物进行特异性验证。
[0038]收集16个病原真菌、2个植物病原细菌和2个水稻品种，分别提取DNA，用19对巢式 PCR引物进行扩增。扩增结果显示在这19个物种中都扩增不到目的条带。说明这19对巢式 PCR检测引物具有较高的特异性。
[0039]将稻曲菌DNA进行浓度梯度稀释，用19对巢式PCR检测引物分别进行扩增，结果显 示编号为G544靶标的相应巢式PCR引物Uv-1F/Uv-1R，UV-2F/Uv-2R可以检测到最低浓度为 lfg/μL的稻曲菌DNA，灵敏度最高（图3)。
[0040] 所以综合稳定性（图1)、特异性（图2)和灵敏度结果（图3)，选取编号为G544靶标的 相应巢式PCR引物Uv-IF/Uv-IR，Uv-2F/Uv-2R作为稻曲菌的特异性检测引物，第一轮扩增结 果为453bp，第二轮扩增结果为366bp。
[0041] 特异性引物的核苷酸序列如下所示(5'_3'）：
[0046] 靶标基因 G544的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
[0047] 巢式PCR扩增体系如下：
[0049] 所用Taq DNA polymerase购自TaKaRa公司。
[0050] 巢式PCR扩增程序如下：
[0052] 3.稻曲菌特异性检测引物Uv-IF/Uv-IR，Uv-2F/Uv-2R的应用
[0053]为了验证该巢式PCR检测引物在具有高背景的混合DNA样品中依然可以准确检测 到稻曲菌DNA。取PSA平板上28°C培养7天的稻曲菌HWD-2菌丝块放入50ml PSB液体培养基 中，28°C，150rpm摇培7天获取菌丝孢子混合液。用2ml稻曲菌HWD-2的菌丝孢子混合液(孢子 浓度为1 X l〇6/ml)以PSB液体培养基为对照，在水稻孕穗7-8期对穗包进行注射接种(Jia et al.，2014)。用稻曲菌菌丝孢子和对照PSB液体培养基分别注射接种20个稻穗，在25°C， 100%湿度的环境下，保湿培养2天后，随机选取3个接种稻曲菌的水稻稻穗和3个注射2ml PSB作为对照的水稻稻穗提取DNA，用Uv-1F/U v-1R、UV-2F/Uv-2R引物进行巢式PCR检测，发 现接种了稻曲菌的穗子都可以检测到稻曲菌的存在，对照均扩增不到目的片段（图4)。而且 说明该检测引物可以在混合DNA样品中检测到稻曲菌的DNA。
[0054]在面积为1亩的水稻田中，对孕穗期水稻进行5点法取样，每点取1株水稻。将每株 水稻分成根、茎、叶和穗4个部分，分别提取DNA用Uv-1F/Uv-1R、UV-2F/Uv-2R引物进行巢式 PCR检测，发现在田间自然生长水稻的的根、茎、叶和穗中都可以检测到稻曲菌的存在（图 5)。说明这对检测引物可以在田间进行应用。
【主权项】
1. 一组稻曲菌PCR检测引物，其名称与核苷酸序列为： Uv-1F：TCTTGGCTCCTCGGAAGCTC Uv-1R：CATGTCTTGCCCAAAGATGCG Uv-2F：AGGTTCTACATGCGTGTTGTGA Uv-2R：GCCCTGTGAAACTTGGTGC 〇2. 权利要求1所述的引物在稻曲菌PCR检测中的用途。3. -种稻曲菌PCR检测方法，其特征在于：提取水稻的DNA，用权利要求1所述的引物进 行巢式PCR检测。
【文档编号】C12R1/645GK105969871SQ201610409325
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】郑露, 汤近天, 黄俊斌, 张耀
【申请人】华中农业大学