用于检测微量组织中braf基因突变的引物组合及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测微量组织中BRAF基因突变的引物组合，其包括预扩增引物组、用于检测11号外显子突变的引物组、用于检测15号外显子突变的引物组；该方法旨在将微量的DNA通过预扩增得到较高浓度的DNA模板，结合直接测序法检测样本中BRAF基因的突变情况；将该引物组合应用于制备检测BRAF基因突变的检测试剂中，可检测样本的DNA浓度低至100pg，且可以同时检测BRAF基因第11和15号外显子的所有突变，本发明提供的检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，适用于临床肿瘤患者BRAF基因突变的检测，具有很好的临床应用价值。
【专利说明】
用于检测微量组织中份iVIf基因突变的引物组合及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于微量组织中基因突变检 测的引物组合及其在肿瘤用药选择和疾病诊断相关方面的应用。
【背景技术】
[0002] 基因是1988年由Ikawa等首先在人类尤因肉瘤中发现并克隆确认的一种能 转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列。BRAF基因与ARAF、CRAF基因同属RAF家族，命名为鼠类 肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，位于人染色体7q34，长约190kb，编码783个氨基酸的蛋白， 相对分子质量为84436,有CR1、CR2和CR3三个保守区。BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通 路重要的转导因子，其功能的编码区由2510对碱基组成，主要通过有丝蛋白激酶通路中的 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用，该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核 内的转录因子相连接，启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和 调亡(Wanchoo R, et al, 2016; Mandal R, et al, 2016)。研究表明，在多种人类恶性肿 瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌，均存在不同比例的BRAF 突变（Caparica R, et al, 2015; Semrad TJ, et al, 2016)。
[0003] F突变主要有两种类型：1.11%位于exonl 1上的甘氨酸环，如G463、G465、G468 的点突变;2.89%的突变发生在exonl5上的激活区，其中约92%位于第1799核苷酸上，T突 变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)(G er^ler B，et al，2015)。此外，仅不 至Ijl%的癌组织同时存在突变与RAS突变，且在这1%中，突变几乎均为非V600E 突变。以上两种类型的突变均能使BRAF激酶活性及NIH3T3细胞转化能力提高，但以后者更 为重要。V600E突变能模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。
[0004] 2011年Π )Α批准维罗非尼用于治疗晚期（转移性)或不可切除的黑色素瘤，尤其是 携有BRAFV600E基因变异肿瘤者。该药的安全性和疗效评估基于一项国际单中心研究。该研 究纳入675例BRAFV600E变异的初治晚期黑色素瘤患者，入选者被随机分入维罗非尼组或达 卡巴嗪组。结果显示，在维罗非尼组患者未达到中位生存期终点时（77%的患者生存），达卡 巴嗪组患者中位生存期为8个月（64%的患者生存）。BRAF是位于KRAS下游级联信号通路上的 一个重要蛋白，当BRAF基因发生突变后，其编码生成的蛋白产物无需接受上游信号蛋白的 活化便始终处于激活状态，启动下游细胞信号转导途径，引起细胞增殖，从而使EGFR抑制剂 西妥昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体等疗效减弱或无效。因此，肿瘤病人在用药之前进行 BRAF基因的突变检测，将有利于这些患者选择最好的治疗方式。
[0005] 目前针对突变的检测方法有很多，如直接测序法，该法对样本要求较高，检 测范围有限。多态性分析法(RFLP)，是将PCR与限制性酶切相结合的一种方法，此实验操作 繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。Taqman水解探针法，使 用扩增阻滞突变系统(ARMS)与荧光探针结合来检测突变，针对该方法设计的引物，使得突 变型得到扩增，野生型无法扩增，从而增强了突变信号，便于检测。但是ARMS技术应用最后 一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，存在假阳性的风险，且只能针对特异性 位点检测。此外，如高效液相色谱、毛细血管电泳等，需要特殊的仪器设备，且操作复杂，不 利于在临床上进行大范围的推广。核酸序列扩增法(NASBA)、自序序列复制法(3SR)和链置 换复制法(SDA)虽均为等温扩增法，但是它们对目的序列的扩增特异性不强。
[0006] 尽管如此，突变的检测方法仍以肿瘤组织标本检测为金标准，但是临床上 常常由于组织样本获取不足量，使其检测具有一定的局限性。因此临床上亟需一种高效准 确全面地检测微量组织中基因突变的产品及方法，以便于为肿瘤个性化治疗服务。
[0007] 为此，本发明利用恒温扩增与直接测序相结合的方法，建立了一套针对微量组织 样本中基因所有突变类型检测的技术流程，该检测方法灵敏度高，特异性强，成本 低，有利于临床使用和推广。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种具有高特异性和灵敏度的检测微量组织样本中 基因突变的引物组合，以组织DNA为检测对象，结合恒温预扩增技术和普通PCR技术，通过直 接测序法确定肿瘤样本中有无5 F基因突变，可对F基因的突变进行准确的检测。
[0009] 本发明提供的引物组合能检测出洲#基因发生在第11和15号外显子的所有突变。
[0010] 本发明提供的用于检测似#基因突变的引物组合包括如SEQ ID N0:1- SEQ ID NO: 18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示的用于检测11号外显子 突变的引物组、如SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:22所示的用于检测15号外显子突变的引物组。
[0011] 本发明的另一目的是将上述引物组合应用在制备检测仰#基因突变的检测试剂中。
[0012] 本发明的另一目的是将上述引物组合应用于制备用于检测基因突变的检 测试剂盒中，所述试剂盒组分还包含下列常规组分中的一种或几种:聚合酶、引物组合、PCR 反应缓冲液、dNTP、BSA、去离子水。
[0013] 本发明用于检测基因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下： (1)引物稀释 将primerl_primel8分别稀释后混勾制得Primer Mix(表1)，其中primerl_primerl6引 物的终浓度为0 · 05-0 · ΙμΜ，primer 17-primer 18引物的终浓度为 1_3μΜ;primer 19_primer22 引物(表1)稀释至5-10μΜ。
[0014] (2)预扩增 在扩增管中加入lyL的10X反应缓冲液、2·5yL的Primer Mix、100-1000pg微量DNA模板 (本发明采用的DNA模板来源于结肠癌病人组织，并按照《分子克隆实验指南》中所述常规方 法提取组织DNA)、用去离子水补足至8.8yL;混匀，98°C预变性5-10min，然后置于冰上10-2〇min;再加入0.5yL dNTP (10mM each)、0.2yL 100XBSA以及0.5yL phi29 DNA聚合酶， 30-35°C扩增过夜，65°C加热10_20min使酶失活。
[0015] (3)使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物。
[0016] (4)57^尸基因突变检测 针对基因的11、15号外显子突变，分别采用如SEQ ID N0:19- SEQ ID N0:20所 示的引物组检测11号外显子突变;如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的引物组检测15号 外显子突变。
[0017] 配置PCR反应总体系为25yL:其中Pfu Mix混合液12.5yL、所述正向引物（5-10μΜ) 的体积〇.5-lyL、反向引物（5-10μΜ)的体积0.5-lyL、预扩增产物l-2yL、用水补足至25yL。 PCR反应条件为:①94°C，5min预变性;②94°C，30s变性;③55°C，30s退火;④72°C，35s延伸； 循环②至④35次;⑤72 °C，5min;测序检测。
[0018] 本发明的检测优势在于:①本发明采用多引物组合、利用恒温扩增及普通PCR相结 合的方法，解决了组织样本中初始DNA含量低的，无法进行基因突变检测的局限性； ②本发明中使用的试剂价格低廉，可大批量的处理样本；③本发明方法扩增效率高，如 100pg的DNA经扩增后可得到lOOOng/yL;可同时检测多位点的突变情况;④本发明方法DNA 扩增后DNA忠实性好。总之，使用本发明方法可实现对微量组织样本中的'基因的突变 情况进行高效、准确的检测，其对于临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，以及监测肿瘤的预 后具有很好的实际应用价值。
[0019] 表1:引物1-22的核苷酸序列
【附图说明】
[0020] 图1是本发明针对l〇〇〇pg的DNA模板扩增结果;其中A图为预扩增结果(3次重复）;B 图为F基因11、15号外显子扩增结果； 图2是本发明针对500pg的DNA模板扩增结果;其中A图为预扩增结果(3次重复）;B图为 因11、15号外显子扩增结果； 图3是本发明针对100pg的DNA模板扩增结果。A图为预扩增结果（3次重复）；B图为 因11、15号外显子扩增结果； 图4是本发明针对100(^的0嫩模板中5以，基因11、15号外显子测序结果图； 图5是本发明针对500pg的DNA模板中万以厂基因11、15号外显子测序结果图； 图6是本发明针对100?8的0嫩模板中57^，基因11、15号外显子测序结果图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可以根据上述本
【发明内容】
对本发明做 出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为分析纯，所有试 剂均可从商业渠道获得，百分比均为质量百分比。文中未注明具体条件的实验方法，通常按 照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。除非另行定 义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
[0022] 实施例l:1000pg的DNA模板中基因突变检测 1、实验材料 phi29 DNA聚合酶，lOXreaction buffer，dNTP (10nM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-p;rimel8 (即Primer Mix)，2XPfu Mix，primerl9-p;rimer22，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。 [0023] 2、实验步骤及结果 2.1预扩增 (1) 引物稀释 将primerl_primel8分别稀释后混勾形成Primer Mix(表1)，其中primerl_primerl6引 物的终浓度为〇.1以]?4411^^171411^^18引物的终浓度为2以]\1。配置如下体系：
(2) 将上述试剂混匀后，98°C预变性10min，然后迅速置于冰上20min; (3) 再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测 (图1A)。结果显示使用phi29DNA聚合酶对lOOOpg的DNA模板扩增效果良好。
[0024] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500yL的平衡液BL，12，000 rpm (~13，400 X g) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； (2 )估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液1?，充分混匀(无需去除石蜡 油或矿物油）； (3) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min， 12,000 rpm(~13,400Xg)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中； (4) 向吸附柱CB1中加入600yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12， 000 rpm (~13,400Xg)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中； (5) 重复操作步骤(4); (6) 12，000 rpm(~13，400 X g)离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数 分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验； (7) 取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50yL洗 脱缓冲液EB，室温放置2 min，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心2 min，收集DNA溶液。
[0025] 2.3 57? 基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增5 基因的第11号和15号外显子；
其中针对11号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对15号外显 子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。
[0026] (2)反应条件：①94°C，5min预变性；②94°C，30s变性；③55°C，30s退火；④72°C， 35s延伸；循环②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图1B)，结果显示第二轮PCR对B 基因的第11 和15号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序检 测，测序结果如图4所示，基因第11号外显子发生错义突变c.1391G>T p. G464V，第 15外显子未检测到突变。
[0027] 实施例2:500pg的DNA模板中5 F基因突变检测 1、实验材料 phi29 DNA聚合酶，lOXreaction buffer，dNTP (10nM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-p;rimel8 (即Primer Mix)，2XPfu Mix，primerl9-p;rimer22，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。 [0028] 2、实验步骤 2.1预扩增 (1) 引物稀释。将primer 1-prime 18分别稀释后混勾形成Primer Mix(表1)，其中 primer 1-primer 16引物的终浓度为0 · ΙμΜ，primer 17-primer 18引物的终浓度为2μΜ。配置如 下体系：
(2) 将上述试剂混匀后，98°C预变性lOmin，然后迅速置于冰上20min。
[0029] (3)再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35 °C扩增过夜，65 °C加热15min使酶失活。铺1%的胶检测（图 2A)。结果显示使用phi29DNA聚合酶对500pg的DNA模板扩增效果良好。
[0030] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500 yL的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400Xg) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0031] (2)估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液1?，充分混匀(无需去除 石蜡油或矿物油）。
[0032] (3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400 Xg)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集 管中。
[0033] (4)向吸附柱CB1中加入600 yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm (~13,400Xg)离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管 中。
[0034] (5)重复操作步骤4。
[0035] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放 置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
[0036] (7)取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 yL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12，OOOrpm(~13，400 X g)离心2 min，收集DNA溶液。
[0037] 2.3 5 7? 基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增5 基因的第11和15号外显子，
其中针对11号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对15号外显 子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。
[0038] (2)反应条件：①94°C，5min预变性；②94°C，30s变性；③55°C，30s退火；④72°C， 35s延伸；循环②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图2B)，结果显示第二轮PCR对F基因的第11 和15号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序检 测；测序结果如图5所示，5 基因第11号外显子发生错义突变c.1391G>T p. G464V，第 15外显子未检测到突变。
[0039] 实施例3:100pg的DNA模板中5 F基因突变检测 1、实验材料 phi29 DNA聚合酶，lOXreaction buffer，dNTP (10nM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-p;rimel8 (即Primer Mix)，2XPfu Mix，primerl9-p;rimer22，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。 [0040] 2、实验步骤 2.1预扩增 (1) 引物稀释。将primer 1-prime 18分别稀释后混勾形成Primer Mix(表1)，其中 口1'；[11161'1-口1'；[11161'16引物的终浓度为0.]^]\1，口1'；[11161'17-口1'；[11161'18引物的终浓度为24]\1。
[0041 ] 配置如下体系：
(2) 将上述试剂混匀后，98°C预变性10min，然后迅速置于冰上20min。
[0042] (3)再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35 °C扩增过夜，65 °C加热20min使酶失活。铺1%的胶检测（图 3A)。结果显示使用phi29DNA聚合酶对100pg的DNA模板扩增效果良好。
[0043] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500 yL的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400Xg) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0044] (2 )估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液1?，充分混匀(无需去除 石蜡油或矿物油）。
[0045] (3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12，000 rpm(~13，400 X g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收 集管中。
[0046] (4)向吸附柱CB1中加入600 yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12,000 rpm (~13,400Xg)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入 收集管中。
[0047] (5)重复操作步骤4。
[0048] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放 置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
[0049] (7)取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12，OOOrpm(~13，400Xg)离心2 min，收集DNA溶液。
[0050] 2.3 5 F基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增5 F基因的第11和15号外显子，
其中针对11号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对15号外显 子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示。
[0051 ] (2)反应条件：①94°C，5min预变性；②94°C，30s变性；③55°C，30s退火；④72°C， 35s延伸；循环②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图3B)，结果显示第二轮PCR对5 F基因的第11 和15号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序检 测；测序结果如图6所示，基因第11号外显子发生错义突变c.1391G>T p. G464V，第 15外显子未检测到突变。
[0052]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 用于检测微量组织中基因突变的引物组合，其特征在于:包括如SEQ ID NO :1-SEQ ID NO: 18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO:20所示的用于检测11号 外显子突变的引物组、如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的用于检测15号外显子突变的 引物组。2. 权利要求1所述的引物组合在制备检测基因突变的检测试剂中的应用。3. 权利要求1所述的引物组合在制备检测基因突变的检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105969877SQ201610423410
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】盛苗苗, 罗瑛, 唐文如, 李珊珊, 王芳, 赵月光, 张继虹, 贾舒婷, 吴晓明, 刘静, 周若宇, 旦菊花
【申请人】昆明理工大学