一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法

一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法。一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组，包括：突变型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；野生型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明可用于高通量鉴定高油酸自交后代中aa基因型，解决现有自交后代数量较大无法鉴定的问题，其能够准确快速的获得自交后代中FAD2A所有基因型AA，aa和Aa，及时剔除AA基因型，显著提高高油酸花生育种的效率。
【专利说明】
一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测 方法
技术领域
[00011本发明涉及一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组及检测方法，属 于农业生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 花生是重要的油料作物之一，油酸和亚油酸是其油脂中的主要成分。油酸分子中 只含有一个双价不饱和键，稳定性高，加热时所产生的有害物少;亚油酸分子中含有两个双 价不饱和键，与油酸相比，亚油酸更容易被氧化，稳定性差。因此，花生籽粒油脂中油酸和亚 油酸的比例是衡量油脂品质的重要指标，油酸亚油酸比值高的油品货价寿命长，商品质量 稳定、保质期长。而且油酸有益于人类心、脑、肾和血管的健康，食用油酸可以增加人体内的 高密度脂蛋白的浓度，降低中低密度脂蛋白的浓度，在保证人体对胆固醇需求的同时，防止 胆固醇过量(Davis et al. ,2008)，因此，高油酸花生越来越受到人们的青睐，高油酸花生 品种的选育工作也越来越受到人们的重视。
[0003] 1987年，美国科研人员首次鉴定了高油酸花生突变体F435,其油酸亚油酸比值高 达40:l(N 〇rden et al.，1987)，并以此突变体为材料培育出了一系列高油酸花生品种，如 Sun01eic95R，其油酸含量高达85%，超过了橄榄油的油酸含量。研究发现，花生高油酸特性 由2个主效基因控制，Jung等从普通花生及高油酸花生突变体（以Sun01eic95R为父本杂交 获得）中分离了这两个基因:AhFAD2A和AhFAD2B。这两个基因均编码Λ12-脱氢酶，主要作用 是催化油酸在碳12位去饱和产生亚油酸，是控制油酸和亚油酸含量的关键酶。在普通花生 中这两个基因编码区同源性为99%，二者只有11个碱基的差别，翻译产物在4个位置上有不 同的氨基酸残基。研究表明，AhFAD2A来源于花生野生种Α基因组，AhFAD2B来源于花生野生 种B基因组，无论AhFAD2B还是AhFAD2A都不是种子特异表达的基因，两个基因之一正常表 达，其油酸水平即可稳定在正常水平(Jung et al.2000a;2000b)。研究表明，在高油酸花生 突变体F435中FAD2B442bp处有一单核苷酸"A"插入，其插入导致移码突变，从而产生无活性 蛋白质;在FAD2A 448bp处有单个核苷酸G到A的替换，结果是AhFAD2A编码的Λ12-脱氢酶活 性降低。基于高油酸突变体F435中FAD2的序列变化，发展了一些鉴定FAD2基因型的方法。如 〇八？5(2007 ;2009)，？0?产物测序法('^1^6七&1.，2010)，荧光定量？0?法（2010;2011)，八5-PCR法(Chen et al.，2010)。上述检测方法或操作复杂，或成本太高，或效率太低，因此，开 发一种高通量，低成本，高准确率的检测方法，将其应用到花生高油酸育种过程中显得十分 必要。

【发明内容】

[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的 引物组及检测方法，该方法具有通量高，成本低，准确率高的特点，为分子标记辅助选择高 油酸杂交后代提供了新的技术手段。
[0005] 术语说明：
[0006] FAM:6-羧基荧光素，一种常用的荧光基团，用于标记核苷酸和核酸，激发光波长 495nm，发射光波长521nm，颜色呈绿色。
[0007] HEX:六氯-6-甲基荧光素，激发光波长535nm，发射光波长556nm，颜色呈粉红色。 [0008]本发明的技术方案如下：
[0009] 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组，包括：
[0010]突变型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.l所示；
[0011]野生型特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0012]通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0013] 根据本发明优选的，所述的突变型特异引物还包括SEQ ID No.l所示的核苷酸序 列的5'端连接有与焚光基团序列相同的Allele-1 tail序列；进一步优选的，所述Allele-Rail 序列的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4 所示。 SEQ ID N0.4 所示的核苷酸序列为与 FAM 荧光 基团序列相同的片段；
[0014] 所述突变型特异引物由22个碱基组成，核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，该序列为 AhFAD2A基因突变型开放读码框区自5'端448-469位碱基的反向互补序列；在突变型特异引 物的5'端连接了A1 lele-1 tail，这条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的 通用荧光探针的序列相同，探针的5'端分别标记了 FAM荧光基团，该探针包含在LGC公司研 发销售KASP Mix中。
[0015]根据本发明优选的，所述的野生型特异引物还包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序 列的5'端连接有与荧光基团序列相同的Allele-2tail序列；进一步优选的，所述Allele-2tail序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为与HEX荧光 基团序列相同的片段；
[0016] 所述野生型特异引物由22个碱基组成，核苷酸序列SEQ ID No.2所示，该序列为 AhFAD2A基因野生型开放读码框区自5'端448-469位碱基的反向互补序列；在突变型特异引 物的5'端连接了411616-2丨3；11，这条加尾序列分别与1^(：公司1&18丨61111检测试剂盒中的 通用荧光探针的序列相同，探针的5'端分别标记了 HEX荧光基团，该探针包含在LGC公司研 发销售KASP Mix中。
[0017] 由于花生AhFAD2A和AhFAD2B基因之间重复序列的干扰，KASP标记很难区分具有同 源性很高AhFAD2A和AhFAD2B基因间的SNP，根据KASP竞争性PCR的原理，本发明充分利用通 用引物SEQ ID No. 3，将3 '末端碱基设计在AhFAD2A和AhFAD2B的A和B基因组之间SNP位点， 用于区分A和B基因组，用特异性引物来区分要检测的特异性功能位点。序列表中SEQ ID No. 3由18个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因开放阅读框区自5 '端415-432位碱基序列。
[0018] 利用上述引物组高通量筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，步骤如下：
[0019] (1)提取待筛选样品的基因组DNA;
[0020] (2)以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物组进行高通量实时荧光定 量PCR，制得PCR产物；
[0021 ] (3)对步骤（2)制得的PCR产物进行荧光检测分析，当检测到仅有FAM探针的荧光 时，则第448位为碱基A纯合，即突变体基因型，记为aa;当检测到仅有HEX探针的荧光时，则 448位为碱基G，即野生型，记为AA;当同时检测到有FAM探针和HEX探针的荧光时，则448碱基 为杂合子，记为Aa。
[0022]根据本发明优选的，所述步骤(2)中的实时荧光定量PCR的反应体系为3yL，组分如 下： 2、： KASPPCR mix 1.5 μL_. 0.16 μΜ突变型特异引物 0.048 pL 0.16 μΜ野生型特异引物 0.048丨止 「00231 0,41 μΜ 通用引物 0.123 pL DNA模板 35~45 ng 加入ddH20至总体积 3 |iL.。
[0024] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR的反应程序为：
[0025] 94Γ 预变性 15min;
[0026] 第一步扩增反应:94°C预变性20s;65°C~55°C60s，10个循环，每个循环降低1°C;
[0027] 第二步扩增反应:94°C预变性20s;55°C60s，35个循环。
[0028]根据本发明优选的，所述步骤(2)中的高通量实时荧光定量PCR中，DNA模板稀释及 转板在TECAN液体自动化工作站上进行;反应体系中反应物的添加混合通过Meridian?液体 处理工作站加入至384PCR反应板中；PCR反应、检测荧光强度、读取数据均在Hydrocycle? PCR水浴中完成。
[0029]根据本发明优选的，所述步骤(3)中的荧光检测分析，荧光信号读取采用Omega F 荧光阅读仪;数据结果采集、分析采用LGC公司Kraken软件进行。LGC公司Kraken软件进行可 高通量检测AhFAD2A基因 G碱基到A碱基的置换。
[0030] 有益效果
[0031] 1、本发明开发了针对FAD2A突变位点（448bp处G:C-A:T突变）的引物组及高通量 检测方法，一次检测样本量最高可达5376 (384 X 14)个，该检测方法具有通量高，成本低，结 果稳定的优点；与PCR产物测序法、CAPS方法比较，该方法操作简单，检测成本低；用CAPS结 果验证显示，该方法结果可靠；
[0032] 2、本发明可用于高通量检测杂交FlS回交育种中的Aa基因型后代;通过对杂交后 代的检测，选择基因型为Aa的后代，能极大提高目标性状选择的准确性，减少后期选育的工 作量；
[0033] 3、本发明可用于高通量鉴定高油酸自交后代中aa基因型，解决现有自交后代数量 较大无法鉴定的问题，其能够准确快速的获得自交后代中FAD2A所有基因型AA，aa和Aa，及 时剔除AA基因型，显著提高高油酸花生育种的效率。
【附图说明】
[0034]图1为实施例2中部分KASP法检测样品中AhFAD2A基因各基因型点簇分布图；
[0035]图2为实施例3中CAPS法检测AhFAD2A各基因型的电泳照片；
【具体实施方式】
[0036]下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保 护范围不限于此。
[0037] 下述实施例中所有方法如无特殊说明均为常规方法。
[0038] 所述引物均由Lifetech公司合成。
[0039]实施例1.供试花生样品基因组DNA的提取
[0040] 按TIANGEN公司提供的植物基因组DNA提取试剂盒（目录号:DP-305)说明书中的记 载提取供试花生样品基因组DNA，具体步骤如下：
[0041]①在液氮中研磨l〇〇mg新鲜或20°C冷冻的样品材料(注:样品要快速、充分研磨为 粉末）；
[0042]②将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700yL，65°C预热的缓冲液GP1的离心管中 (实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0. lwt% )，迅速颠倒混匀后，将离心管 在65°C水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
[0043]③加入700yL氯仿，充分混匀，12，OOOrpm离心5min;注:若提取富含多糖或淀粉的 植物组织，可在第③步前，用酚:氯仿(体积比1:1)进行等体积抽提；
[0044]④将所得上层水相转入一个新的离心管，加入700yL的缓冲液GP2，充分混匀；
[0045]⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3，12，000rpm离心30s，弃掉废液；
[0046]⑥向吸附柱CB3中加入500yL缓冲液GD(使用前检查是否己加入无水乙醇），12， OOOrpm离心30s，弃掉废液；
[0047] ⑦向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前检查是否己加入无水乙醇），12， OOOrpm离心30s，倒掉废液；
[0048]⑧重复步骤⑦；
[0049]⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12,000印111离心21^11，倒掉废液。将吸附柱083置于 室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;注意:这一步的目的是将吸附柱中 残余的漂洗液去除，漂洗液中无水乙醇的残留会影响后续的酶反应实验；
[0050] ⑩将吸附柱CB3放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量50~200 yL洗脱缓冲液TE(pH值在7.0~8.5之间），室温放置2-5min。12，OOOrpm离心2min收集DNA溶 液；
[0051] 最后用紫外分光光度计检测DNA的含量及纯度，结果显示所测样品A260/280介于 1.8~2.0之间，表明所提取的DNA纯度较高。
[0052]实施例2.用于检测AhFAD2A基因448位G>A置换突变的引物设计 [0053] AhFAD2A基因基因组序列开放读码框第448位碱基序列存在从野生型核苷酸G置换 为突变型核苷酸A的突变，突变结果是导致编码的蛋白活性降低。根据上述突变位点的位 置，设计KASP等位基因差异引物，如表1所示，使AhFAD2A基因的差异序列位于引物的3'末 端，而5'端分别连接了411616-]^3；[1和411616-2七3；[1，这两条加尾序列与1^(]公司]\^18七61 Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5'端分别标记了FAM和HEX荧光基团。 根据AhFAD2A基因组序列开放读码框序列，设计通用引物，如表1所示。
[0054]表 1
[0056] 表1中SEQ ID No.l由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因突变型开放读码框自 5'端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5'端连接了Allele-1 tail，这条 加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5' 端分别标记了FAM荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
[0057] 表1中SEQ ID如.2由22个碱基组成，该序列为六1^六02六基因野生型开放读码框区 自5'端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5'端连接了 Allele-2tail，这 条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的 5'端分别标记了HEX荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
[0058] 表1中SEQ ID如.3由18个碱基组成，该序列为六1^六02六基因开放阅读框区自5'端 415-432位碱基序列。由于花生AhFAD2A和AhFAD2B基因之间重复序列的干扰，KASP标记很难 区分具有同源性很高的AhFAD2A和AhFAD2B基因的SNP，根据KASP竞争性PCR的原理，本发明 充分利用通用引物SEQ ID No. 3，将3'末端碱基设计在AhFAD2A和AhFAD2B的A和B基因组之 间SNP位点，用于区分A和B基因组，用特异性引物来区分要检测的特异性功能位点。
[0059] 实施例3.花生AhFAD2A基因突变位点的检测
[0060] 采用实施例2中根据AhFAD2A基因等位差异设计的引物组对供试花生材料包括普 通油酸花生(基因型AABB)为母本与高油酸花生(基因型aabb)为父本杂交的Fjf杂种、F 2代 分离群体进行检测，同时以CAPS和PCR产物测序法验证的AA，aa和Aa基因型样品为阳性对 照，以无模板为阴性对照，具体方法如下：
[0061] 3.1PCR 反应体系：
[0062]采用实施例1所述的方法对样品进行基因组DNA的提取，提取获得的基因组DNA作 为模板，利用实施例2所述的突变型特异引物、野生型特异引物、通用引物和LGC试剂盒产品 Master Mix荧光探针配制反应体系，检测AhFAD2A基因开放读码框第448位碱基序列G>A等 位差异。
[0063] DNA模板稀释及转板在TECAN液体自动化工作站上进行，在Meridian?液体处理工 作站上将DNA和PCR mix加入384PCR反应板中，在Hydrocycle? PCR水浴中完成PCR反应;PCR 总反应体系为3yL，组分如下：
[0065]加样完毕后，低速离心、封膜。
[0066] 3.2PCR扩增反应条件：
[0067] 94Γ 预变性 15min;
[0068] 第一步扩增反应:94°C预变性20s;65°C~55°C60s，10个循环，每个循环降低1°C;
[0069] 第二步扩增反应:94°C预变性20s;55°C60s，35个循环。
[0070] PCR扩增结束后，当反应温度降至40°C以下，读取数据，数据读取使用LGC公司 Kraken软件进行。
[0071] 3.3数据分析
[0072]对于AhFAD2A基因第448位碱基等位差异检测，使用两对荧光探针(分别识别等位 基因引物5 '端的加尾序列），标有FAM的探针与突变型等位基因（a)完全匹配，标有HEX的焚 光探针与野生型等位基因完全匹配(A)。
[0073] 对步骤3.2的检测结果进行分析，分析使用LGC公司Kraken软件进行，当检测到仅 有FAM探针的荧光时，则第448位为A碱基纯合，即突变基因型，记为aa;当检测到仅有HEX探 针的荧光时，则第448位G碱基纯合，即野生基因型，记为AA;当检测到有HEX探针和FAM探针 的荧光时，则第448位为杂合子，记为Aa。
[0074] 对等位基因鉴定分析实验进行设计时，分别以无模板对照、确定仅含有野生型等 位基因 A、突变型等位基因 a、含野生型、突变型等位基因（Aa)的杂合花生品种为标准。未知 样本将分为以下3类:①野生型:样本中只含有纯合基因 AA;②突变型:样本中只含有纯合基 因 aa;③杂合子:样品中同时含有等位基因 A和等位基因 a。
[0075] 为验证本发明的可行性和准确性，实验室选取50个未知基因型样本进行CAPS法检 测，确定其基因型后对这些样品进行KASP检测，用以验证KASP-PCR检测方法的准确率。检测 结果如表2所示，从表中可以看出，KASP检测结果与CAPS法验证的结果一致率达到96%。因 此，本发明建立的AhFAD2A SNP基因分型的KASP高通量检测体系，能够有效降低高油酸花生 育种成本，缩短育种时间，提高育种效率。
[0076] 表 2
[0078] 对比例用于检测AhFAD2A基因448位G>A置换突变的引物设计
[0079] 表3中SEQ ID No.l由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因突变型开放读码框自 5'端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5'端连接了Allele-1 tail，这条 加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5' 端分别标记了FAM荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
[0080] 表3中SEQ ID No.2由22个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因野生型开放读码框区 自5'端448-469位碱基的反向互补序列，在突变型特异引物的5'端连接了 Allele-2tail，这 条加尾序列分别与LGC公司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的 5'端分别标记了HEX荧光基团，该探针包含在LGC公司研发销售KASP Mix中。
[0081 ] 表3中SEQ ID No.6由17个碱基组成，该序列为AhFAD2A基因开放阅读框区自5'端 415-431位碱基序列。本对比例中通用引物SEQ ID No.6为设计引物时基于同一设计思路的 另外一组引物，该组引物中，通用引物3 '末端碱基设计未包含AhFAD2A和AhFAD2B的A和B基 因组之间SNP位点。
[0082]表 3
[0085]为验证本发明的创造性，实验室选取70个已知基因型样本利用对比例中的引物组 进行检测，其中有11个出现错误。准确率为84.3%，远低于本发明实施例2中引物组96%的 准确率。因此，本发明建立的AhFAD2A SNP基因分型的KASP高通量检测体系及引物组具有显 著的技术效果。
【主权项】
1. 一种高通量检测AhFAD2A基因突变位点分型的引物组，其特征在于，包括： 突变型特异引物，核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示； 野生型特异引物，核巧酸序列如SEQ ID No.2所示； 通用引物，核巧酸序列如SEQ ID No.3所示。2. 如权利要求1所述的的引物组，其特征在于，所述的突变型特异引物还包括SEQ ID No.l所示的核巧酸序列的5'端连接有与巧光基团序列相同的Allele-Uail序列。3. 如权利要求2所述的的引物组，其特征在于，所述Allele-ltail序列的核巧酸序列如 沈Q ID NO.4所示。4. 如权利要求1所述的的引物组，其特征在于，所述的野生型特异引物还包括SEQ ID No. 2所示的核巧酸序列的5 '端连接有与巧光基团序列相同的Allele-2化il序列。5. 如权利要求4所述的的引物组，其特征在于，所述Allele-2tail序列的核巧酸序列如 沈Q ID NO.5所示。6. -种高通量筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，其特征在于，步骤如下： (1) 提取待筛选样品的基因组DNA; (2) W步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物组进行高通量实时巧光定量 PCR，制得PCR产物； (3) 对步骤(2)制得的PCR产物进行巧光检测分析，当检测到仅有FAM探针的巧光时，贝U 第448位为碱基A纯合，即突变体基因型，记为aa;当检测到仅有皿X探针的巧光时，则448位 为碱基G，即野生型，记为AA;当同时检测到有FAM探针和皿X探针的巧光时，则44如咸基为杂 合子，记为Aa。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的实时巧光定量PCR的反应体 系为化L，组分如下： 2χ KASP PCR mix 1.5 μL. 化16 μΜ较利要求3所述突变型特异引物 0.048 化16 μΜ权利耍求5所述野生型特异引物 化048 mL 0.41 μΜ通用引物 0.123}止 DNA模板 巧~45ng 加入姐报0至总体积 3 ,uL。8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的高通量实时巧光定量PCR的 反应程序为： 94°C 预变性 15min; 第一步扩增反应:94°C预变性20s; 65°C~55°C60s，10个循环，每个循环降低rC ; 第二步扩增反应:94 °C预变性20s; 55 °C60s，35个循环。9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中的高通量实时巧光定量PCR 中，DNA模板稀释及转板在TECA脚夜体自动化工作站上进行；反应体系中反应物的添加混合 通过Meridian?液体处理工作站加入至384PCR反应板中；PCR反应、检测巧光强度、读取数据 均在Hy化ocycle? PCR水浴中完成。10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的巧光检测分析，巧光信号 读取采用Omega F巧光阅读仪;数据结果采集、分析采用LGC公司Kraken软件进行。
【文档编号】C12N15/11GK105969879SQ201610442388
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】王兴军, 赵术珍, 翟晨光, 景润春, 赵传志, 侯蕾, 刘鑫, 夏晗, 李梦, 李长生, 苏惠, 李爱芹
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心, 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司