一种与斑点叉尾鮰快速生长相关的单倍型snp分子标记及其检测方法和应用
【专利摘要】本发明专利属于水产动物分子标记辅助育种领域，具体涉及一种与斑点叉尾鮰快速生长相关的单倍型SNP分子标记及其检测方法和应用。所述的SNP分子标记从斑点叉尾鮰PRL基因克隆得到，该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明还公布了上述分子标记在斑点叉尾鮰生长性状分子检测中的应用。筛选基因型分别为AA、CC、TT、CC、AA的个体，即单倍型组合为H3/H3(ACTCA/ACTCA)的个体作为选育亲本。本发明的方法，操作简单、检测速度快，大大降低了斑点叉尾鮰亲本筛选的盲目性，可以快速获得生长速度快且遗传稳定的斑点叉尾鮰亲本。
【专利说明】
一种与斑点叉尾鮰快速生长相关的单倍型SNP分子标记及其 检测方法和应用
技术领域
[0001] 本发明专利属于水产动物分子标记辅助育种领域，具体涉及一种与斑点叉尾鮰快 速生长相关的单倍型SNP分子标记及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 斑点叉尾鮰（Ictalures punctatus)原产于美国，是一种重要的水产经济物种， 1984年引入我国，具有肉质细腻、适温范围广、生长速度快、抗病能力强等特点。然而，随着 我国斑点叉尾鮰养殖产业的快速发展，已经出现了明显的生长减慢、体色分化和规格不齐 等种质衰退现象。因此，培育生长快、经济性状好、抗逆性强的斑点叉尾鮰新品种（系）已成 为当前斑点叉尾鮰产业可持续发展亟待解决的重要问题。
[0003] 催乳素(Prolactin，PRL)是由脊椎动物垂体前叶细胞合成和分泌的单链多肽类激 素，具有多种生理功能，主要涉及渗透调节、生长发育、免疫、内分泌以及代谢调控等。催乳 素与生长激素 (Growth hormone，GH)及生长催乳素（Somatolactin,SL)具有相似的结构和 功能，最新的分子进化学研究表明GH基因、PRL基因和SL基因很可能均由古GH基因经多基因 拷贝以及随后漫长的进化过程演变而来。PRL基因已经作为生长性状的候选基因，其SNPs和 SSR多态性与生长性状的关联分析在家禽、畜牧和水产动物中已经有较多的报道。罗非鱼 PRL1基因启动子区的一个SSR位点在不同盐度水平与其生长显著相关。亚洲鲈PRL基因上的 一个SNP位点（c. 264+269T>C)与其体质量、体长等生长性状显著相关，基因型为CC个体的体 质量和体长显著性大于基因型为CT和TT的个体。因此，在斑点叉尾鮰中寻找鉴定PRL基因与 生长性状相关联的SNPs及单倍型分子标记对选育生长速度快且遗传稳定的斑点叉尾鮰亲 本具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与斑点叉尾鮰快速生长相关的单倍型SNP分子标记及其 应用，即利用斑点叉尾鮰PRL基因的一个与斑点叉尾鮰生长性状相关的单倍型SNP分子标记 进行快速生长亲本的筛选和鉴定。
[0005] 本发明专利所采取的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种与斑点叉尾鮰快速生长性状相关的单倍型SNP分子标记，所述的 单倍型SNP分子标记的核苷酸序列如SEQIDN0.1和SEQIDN0 :2所示，在SEQIDN0.1序列 的第296、362、623位的碱基处分别存在A/T、C/T、C/T3个突变 ;在SEQIDN0.2序列的第94 和788位的碱基处分别存在C/T和A/G 2个突变。 一种用于检测上述单倍型SNP分子标记的引物，该引物包括PRLP5~13;所述PRLP5~13 的DNA序列如SEQIDN0:7~15所示。 一种用于检测上述单倍型SNP分子标记的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物PRLP5~ 13。
[0007] 本发明的单倍型SNP分子标记、引物或试剂盒在快速筛选和鉴定生长斑点叉尾鮰 亲本中的应用。
[0008] -种快速生长斑点叉尾鮰候选亲本的筛选和鉴定方法，包括如下步骤:检测斑点 叉尾鮰核心选育群体中的SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示的序列，对核心选育群体中每尾 斑点叉尾鮰候选亲本的每个SNP位点进行分型，选择具有单倍型组合H3/H3(ACTCA/ACTCA) 的个体作为选育亲本。
[0009] 具体包括如下步骤：
[0010] ⑴从核心选育群体中剪取待测斑点叉尾鮰鳍条样品，提取基因组DNA。
[0011] (2)以提取得到的基因组DNA作为模板，利用引物PRLP5/PRLP6、PRLP7/PRLP8进行 SNP位点PCR扩增，PRLP5/PRLP6用于扩增位点g· 296A>T、g· 362C>T和g· 623C>T，PRLP7/PRLP8 用于扩增位点g. 94C>T和g. 788A>G，得到初次PCR产物。引物PRLP5、PRLP6、PRLP7和PRLP8的 DNA序列如SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9和SEQIDN0:10所示。
[0 012 ] ( 3)将步骤（2 )中扩增得到的P C R产物纯化后，分别使用引物P R L P 9、P R L P10、 PRLP11、PRLP12和PRLP13进行延伸反应后，在ABI自动遗传分析系统上进行检测分析，确定 待测候选亲本每个SNP位点的基因型。引物PRLP9、PRLP10、PRLP11、PRLP12和PRLP13的DNA序 列如SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14和SEQIDN0:15所示。 [0013] (4)分析每尾候选斑点叉尾鮰亲本的单倍型组合，将单倍型组合为H3/H3(ACTCA/ ACTCA)的亲本选择出来留种以备后续配种。
[0014] SNP位点PCR扩增使用即用型UtraTaq酶PCR试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司）， 反应体系为： 2X UliraTaq Master Mix 20 pL: 基因组DNA 2 pL 1 OP上下游引物 2μ[ ddH20 14liL
[0015] 扩增条件为：94°c预变性5min; 94°C变性30s，退火30s，72 °C延伸60s，30个循环；72 °C 延伸 lOmin。
[0016] SNPs分型使用ABI SNaPshot Multiplex PCR试剂盒(ABI，美国），反应体系为6yL: Snapshot Mix 1 μL 延伸引物 0.1 μL 纯化PCR产物 2ML ddH20 2.9 μL
[0017] 反应条件为:96 °C预变性lmin; 96°C变性10s，52°C退火5s，60 °C延伸30s，共30个循 环。
[0018] 反应结束后加入 1U ?38七六？，371€6〇111丨11，85°(：15111丨11进行纯化。以661165。311-1201^2 Size Standard为内标，取lyL产物与9yL含有Liz的Hi-Di(GS-120Liz:Hi-Di = 1:200)混合， 95°C变性3min，立即冰浴3min后上测序仪。检测及分析采用ABI PRISM 3730X1型自动遗传 分析系统(ABI，美国），并利用Genemapper v4.1软件进行分型。
[0019] 5个SNPs位点经多重Snapshot方法分型，每个位点均出现3种基因型。利用SHEsis 软件分析这5个SNPs产生的单倍型种类和频率，R软件进行基因型与性状间的关联分析。结 果显示，5个SNPs中，g. 6230T和g. 788A>G对所测量的生长性状有显著性影响(P〈0.05)，5个 位点重构的单倍型，不同单倍型组合对所测量的生长性状都有显著性影响(P〈〇.05)，其中 H3/H3(ACTCA/ACTCA)单倍型组合的体质量和体长值最大。在实际生产中保留单倍型组合为 H3/H3(ACTCA/ACTCA)的斑点叉尾鮰亲本，便可获得生长速度快且遗传稳定的斑点叉尾鮰品 系。该方法相较于传统的选育方法，具有目的性强、操作简单、检测速度快，易于推广等优 点。
[0020] 本发明的方法，大大降低了斑点叉尾鮰亲本筛选的盲目性，缩短育种年限，可以快 速获得生长速度快且遗传稳定的斑点叉尾鮰亲本。
【附图说明】 图1为PRL基因示意图及5个SNPs位点所处的位置 其中，引物对PRLP5/PRLP6扩增出SNP位点g. 296A>T、g. 362C>T和g. 623C>T，引物对 PRLP7/PRLP8扩增出SNP位点g. 94C>T和g. 788A>G，除SNP位点g. 788A>G，其余SNP位点均处于 内含子区域。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1
[0022] 1.1实验动物
[0023] 本实验所用斑点叉尾鮰样本均来自于江苏省淡水水产研究所禄口试验基地。 1997-2004年从美国引进德克萨斯（1997)群体、阿肯色（1999)群体、密西西比（2001)群体、 阿肯色（2003)群体和阿肯色（2004)群体405尾建立育种基础群体，利用基础群体进行G0代 家系构建。2013年6月利用G0代家系构建G1代家系，为了减小环境对斑点叉尾鮰生长的影 响，苗种培育按照同一标准进行，即均一的换水速率、投喂量、养殖密度、充氧量以及水温。 待到家系平均日龄为520d时扫描记录存活个体编号，采集每尾鱼的尾鳍组织，95%酒精浸 泡，一20°C保存。
[0024] 在本发明中，所述的斑点叉尾鮰生长性状主要包括:体质量和体重。
[0025] 1.2引物设计
[0026] 根据GenBank数据库公布的斑点叉尾鮰PRL全基因序列(AF267990.1)，使用Primer Premier 5软件设计两对引物?1?1^1/?1?1^2、？1?1^3/?1?1^4，扩增产物大小分别为1762匕口和 1776bp〇
[0027] 1.3PCR 扩增
[0028] PCR扩增使用即用型UtraTaq酶PCR试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司），反应体 系为： 2X UltraZivi/ Master Pvlix 20 μL 基因组DNA 2 .llL 10P上下游引物 2μ【 ddH20 14 μL
[0029] 扩增条件为：94°C预变性5min; 94°C变性30s，退火30s，72 °C延伸2min，30个循环； 72 °C延伸1 Omin。1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像仪观察电泳结果。
[0030] 1.4测序
[0031]紫外灯下切胶纯化回收PCR产物，每对引物的PCR产物各选取12个样本，送至上海 生工生物工程股份有限公司，直接使用ABI 3730XL测序仪(ABI，美国）测序。使用chromas软 件观察测序峰图，结合ClustalX软件进行DNA序列比对来判断SNP位点的碱基类型。
[0032] 1.5SNPs 分型
[0033] 利用引物 PRLP5/PRLP6、PRLP7/PRLP8 进行 SNPs 位点 PCR 扩增，PRLP5/PRLP6 用于扩 增位点 g · 296A>T、g · 362C>T和 g · 623C>T，PRLP7/PRLP8 用于扩增位点 g · 94C>T和g · 788A>G，得 到初次PCR产物。
[0034] 分别使用引物PRLP9、PRLP10、PRLP11、PRLP12和PRLP13进行延伸反应后，在ABI自 动遗传分析系统上进行检测分析，确定待测候选亲本每个位点的基因型。
[0035] SNPs位点PCR扩增使用即用型UtraTaq酶PCR试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公 司），反应体系为： 2X UIlra7i：/i/ Master Mix 20 μL 基因组DNA 2 nL 10P上下游引物 ddH20 14 μL
[0036] 扩增条件为:94°C预变性5min; 94°C变性30s，退火30s，72 °C延伸60s，30个循环;72 °C 延伸 lOmin。
[0037] SNPs分型使用ABI SNaPshot Multiplex PCR试剂盒(ABI，美国），反应体系为6yL: Snapshot Mix 1 [,lL 延伸引物 （λ ? μι 纯化PCR产物 2 μ1_. ddH20 2.9
[0038] 反应条件为:96 °C预变性lmin; 96°C变性10s，52°C退火5s，60 °C延伸30s，共30个循 环。
[0039] 反应结束后加入 1U ?38七4?，371€6〇111丨11，85。(：15111丨11进行纯化。以661165。311-1201^2 Size Standard为内标，取lyL产物与9yL含有Liz的Hi-Di(GS-120Liz:Hi-Di = 1:200)混合， 95°C变性3min，立即冰浴3min后上测序仪。检测及分析采用ABI PRISM 3730X1型自动遗传 分析系统(ABI，美国），并利用Genemapper v4.1软件进行分型。
[0040] 1.6单倍型构建与关联分析
[00411利用SHEsis软件分析这5个SNPs产生的单倍型种类和频率，R软件进行基因型与性 状间的关联分析，使用广义线性模型(GLM)进行计算。具体模型:Yi j = y+Gi+ei j，式中：Yi j 为某个性状第i个标记第j个个体观测值;μ为实验观测所有个体的平均值(即总体平均值）； Gi为第i个标记的效应值;e i j为对应于观察值的随机残差效应。
[0042] 1.7结果分析
[0043] 序列比对结果显示在PRL基因上共检测到5个SNPs，分别为g.296A>T、g.362C>T、 8.62301'4.9401'和8.7884>6，均位于非编码区。其中8.296六>1'4.36201'和8.62301'均位 于第二内含子，g.94C>T位于第四内含子，g.788A>G位于3'端侧翼序列，如附图1所示。这5个 SNPs位点经多重Snapshot方法分型，每个位点均出现3种基因型。5个SNPs位点重构形成7种 单倍型，产生10种单倍型组合。关联分析结果显示，不同单倍型组合对生长性状均有显著影 响(P〈0.05)，其中H3/H3(ACTCA/ACTCA)单倍型组合的体质量和体长值最大。因此，PRL基因 的5个SNPs构成的单倍型分子标记可以运用到斑点叉尾鮰分子标记辅助选育中。
[0044]表1斑点叉尾鮰PRL基因单倍型组合与生长性状的关联分析
[0047] 注：不同小写字母表示差异显著（P〈0.05)，不同大写字母表示差异极显著（P〈 0·01)〇
【主权项】
1. 一种与斑点叉尾鮰快速生长相关的单倍型SNP分子标记，其特征在于:所述的单倍型 SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；在该序列的第296、362、623位的碱基处分 别存在A/T、C/T、C/T3个突变。2. -种与斑点叉尾鮰快速生长相关的单倍型SNP分子标记，其特征在于:所述的单倍型 SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示;在该序列的第94和788位的碱基处分别存 在C/T和A/G 2个突变。3. -种用于检测权利要求1或2所述单倍型SNP分子标记的引物，其特征在于:所述的引 物包括PRLP5~13;所述PRLP5~13的DNA序列如SEQ ID N0:7~15所示。4. 一种用于检测权利要求1或2所述单倍型SNP分子标记的试剂盒，其特征在于:包含权 利要求3所述的引物。5. 权利要求1或2所述的单倍型SNP分子标记、权利要求3所述的引物或权利要求4所述 的试剂盒在快速筛选和鉴定生长斑点叉尾鮰亲本中的应用。6. -种快速生长斑点叉尾鮰亲本的筛选方法，其特征在于:包括如下步骤:检测斑点叉 尾鮰核心选育群体中的SEQ ID N0:1和SEQ ID腸：2所示的序列，选择单倍型组合!13/!13 (ACTCA/ACTCA)的个体作为选育亲本。7. 根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于:包括如下步骤： (1) 从核心选育群体中剪取待测斑点叉尾鮰鳍条样品，提取基因组DNA; (2) 以提取得到的基因组DNA作为模板，利用引物PRLP5/PRLP6、PRLP7/PRLP8进行SNP位 点 PCR 扩增，PRLP5/PRLP6 用于扩增位点 g.296A>T、g.362C>T 和 g.623C>T，PRLP7/PRLP8 用于 扩增位点g. 94C>T和g. 788A>G，得到初次PCR产物； (3 )将步骤（2 )中扩增得到的初次PCR产物纯化后，分别使用引物PRLP9、PRLP10、 PRLP11、PRLP12和PRLP13进行延伸反应后，在ABI自动遗传分析系统上进行检测分析，确定 待测候选亲本每个SNP位点的基因型； (4)分析每尾候选斑点叉尾鮰亲本的单倍型组合，将单倍型组合为H3/H3(ACTCA/ ACTCA)的亲本选择出来留种以备后续配种。8. 根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于：所述SNP位点PCR扩增的引物PRLP5、 PRLP6、PRLP7和PRLP8的DNA序列如SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示。9. 根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于:所述延伸反应的引物PRLP9、PRLP10、 PRLP11、PRLP12和PRLP13的DNA序列如SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示。
【文档编号】C12N15/11GK105969882SQ201610466570
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】张世勇, 边文冀, 陈校辉, 王明华, 秦钦, 钟立强
【申请人】江苏省淡水水产研究所