滇ⅰ型水稻细胞质雄性不育系和保持系的pcr鉴别方法
【专利摘要】本发明公开一种滇Ⅰ型水稻细胞质雄性不育系和保持系的PCR鉴别方法。该方法用两对引物atp6?orf79和LD30组合分别对待检样品进行PCR扩增；同一样品分别用引物atp6?orf79和引物LD30分别扩增出1592bp和788bp单一条带的，该样品为滇Ⅰ型细胞质雄性不育系；同一样品分别用引物atp6?orf79和引物LD30分别扩增，均无扩增条带的，该样品为保持系。本发明方法在水稻种子、苗期即可预期所检材料为可育/败育，不仅在滇Ⅰ型不育系选育过程中可缩短育种年限，减少工作量，而且在种子提纯工作中可提高工作效率，具有操作简单、准确、快速等优点。
【专利说明】
滇I型水稻细胞质雄性不育系和保持系的PCR鉴别方法
技术领域
[0001] 本发明属于农业分子生物技术领域，涉及杂交水稻种质鉴定领域，特别涉及一种 能够准确快速鉴别滇I型杂交粳稻细胞质雄性不育系和保持系的PCR方法。
【背景技术】
[0002] 杂交水稻的应用是我国保证水稻高产的重要措施。长期广泛应用的三系杂交水稻 技术的核心是细胞质雄性不育系。水稻细胞质雄性不育系的纯度是保障三系杂交水稻产量 的一个基本因素。在水稻细胞质雄性不育系繁殖过程中由于需要同田种植保持系为不育系 提供花粉，收获的不育系种子中难免混杂有保持系的种子。但是由于不育系和保持系为同 核异质系，在营养生长阶段两者的形态性状一致，采用现在通用的田间种植方法无法鉴别。 只有待水稻扬花或灌浆期有经验的技术人员才能根据花药和花粉特征或结实情况进行鉴 另IJ，这种传统的方法耗时，而且受包括温度、病虫害等环境因素的影响。滇I型雄性不育细胞 质由云南农业大学李铮友教授在1965年发现，继而在1969年育成第一个细胞质雄性不育粳 稻不育系，是我国杂交粳稻上应用的两个重要的雄性不育细胞质之一。滇I型杂交粳稻不育 系同样具有难于避免保持系混杂的问题。因此，很有必要建立一种用于鉴别滇I型不育系和 保持系的快速可靠的方法。
[0003] 近些年对水稻分子生物学的研究和特异性PCR技术的发展为准确快速鉴别水稻不 育系和保持系提供了有效的方法。利用PCR技术鉴定不育系的纯度克服了传统鉴别方法受 花期限制以及环境影响大等缺点。本发明基于对水稻细胞质雄性不育基因的研究，利用PCR 技术对滇I型细胞质雄性不育系和保持系进行了准确快速鉴别。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种实验条件和操作较为简单、样品用量少，能准确、快速鉴 别滇I型水稻细胞质雄性不育系和保持系的PCR方法，为生产上提供一种鉴别滇I型水稻细 胞质雄性不育系和保持系的实用技术。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 1.鉴别滇I型水稻细胞质雄性不育系和保持系的特异引物，所述特异引物由引物 atp6-〇rf 79和引物LD30组成；所述引物atp6-〇rf 79由上游引物atp6-〇rf 79F和下游引物 atp6-〇rf79R组成，所述上游引物atp6-〇rf79F的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物 atp6-〇rf79R的碱基序列如SEQ ID N0:2所示，目标产物片段长度为1592bp;所述引物LD30 由上游引物LD30F和下游引物LD30R组成，所述上游引物LD30F的碱基序列如SEQ ID N0:3所 示，下游引物LD30R的碱基序列如SEQ ID N0:4所示，目标产物片段长度为788bp。
[0007] 2.滇I型水稻细胞质雄性不育系和保持系的PCR鉴定方法，包括以下步骤：
[0008] (1)从水稻材料中提取DNA样品，每个DNA样品分为两份，一份用技术方案1中所述 的引物atp6-〇rf 79进行PCR反应，另一份用技术方案1中所述的引物LD30进行PCR反应；
[0009] (2)PCR 反应：
[0010] A.引物atp6-〇rf79对每个DNA样品的PCR扩增反应体系总体积为25yL，其中Taq PCR Master Mix 12.5yL，20pmol/L上游引物atp6-〇rf79F 0.25yL，20pmol/L下游引物 atp6-〇rf79R 0.25yL，模板DNA lyL，无菌双蒸水IlyL;完成PCR反应后，放入Eppendorf PCR 仪中，设置引物atp6-〇rf79的PCR扩增程序为:94°C预变性4min，循环内94°C变性30s，55°C 退火30s，72°C复性2min，30个循环后72°C延伸lOmin;
[0011] B.引物LD30对每个DNA样品的PCR扩增反应体系总体积为25yL，其中Taq PCR Master Mix 12.5yL，20pmol/L上游引物LD30F 0.25yL，20pmol/L LD30R 0.25yL，模板DNA lyL，无菌双蒸水1 lyL;完成PCR反应后，放入Eppendorf PCR仪中，设置引物LD30的PCR扩增 程序为:94°C预变性4min，循环内94°C变性30s，55°C退火30s，72°C复性2min，30个循环后72 °C 延伸 lOmin;
[0012] (3)各取5yL PCR扩增产物，分别采用2%的琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色，在电 压120V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照；
[0013] (4)鉴别：同一样品分别用引物atp6-〇rf79和引物LD30分别扩增出1592bp和788bp 单一条带的，该样品为滇I型水稻细胞质雄性不育系；同一样品分别用引物atp6-〇rf79和引 物LD30分别扩增，均无扩增条带的，该样品为保持系。
[0014] 与现有技术相比，本发明的创新点和有益效果是：
[0015] 本发明采用两对特异引物组合进行PCR，提高了鉴别的精确性。在滇I型水稻不育 系的繁种工作以及不育系种子保存工作中，采用本发明方法在水稻种子、苗期即可预期所 检材料为可育/败育，不需等到水稻抽穗开花时期，不仅在滇I型水稻不育系选育过程中可 缩短育种年限，减少工作量，而且在种子提纯工作中可提高工作效率，本发明方法具有操作 简单、准确、快速等优点。
[0016] 序列表中SEQ ID N0:1所示的是引物atp6-〇rf79的上游引物atp6-〇rf79F的碱基 序列。
[0017] 序列表中SEQ ID N0:2所示的是引物atp6-〇rf79的下游引物atp6-〇rf79R的碱基 序列。
[0018] 序列表中SEQ ID从):3所示的是引物0)30的上游引物0)30?的碱基序列。
[0019] 序列表中SEQ ID N0:4所示的是引物LD30的下游引物LD30R的碱基序列。
【附图说明】
[0020] 图1:滇I型水稻细胞质雄性不育系和保持系PCR鉴别结果。图中泳道1、2、3、4为滇I 型水稻细胞质雄性不育系，分别为滇I型细胞质雄性不育系合系42A、滇I型细胞质雄性不育 系合系42A/(CT9993/称杆香糯）、滇I型细胞质雄性不育系榆密15A、滇I型细胞质雄性不育 系H479A。泳道上的各7符号分别代表相邻左侧泳道材料相应的保持系，即泳道上各7符号从 左至右分别为:保持系合系42、保持系CT9993/称杆香糯、保持系榆密15、保持系H479。图1中 a为特异引物atp6-〇rf 79扩增情况，图1中b为特异引物LD30的扩增情况，图1中右侧标示为 PCR扩增片段的分子量大小，Μ为DNA分子量标准。
【具体实施方式】
[0021] 以下实施例无特殊说明为常规方法。
[0022] 1、材料
[0023] 鉴定滇I型细胞质雄性不育系和保持系所用材料如表1所示。
[0024] 表1样品来源表
[0027]表1所示材料已在如下非专利文献中公开，本专利
【申请人】云南农业大学均有保存，
【申请人】保证从本专利申请日起二十年内向公众发放，云南农业大学地址：云南省昆明市盘 龙区黑龙潭黑金路95号，邮编:650201。
[0028] 1、滇I型细胞质雄性不育系合系42A相关文献:程贤宇等，滇I型不育系合系42A高 产繁殖技术，种子，2012,31(2):122。
[0029] 2、滇I型细胞质雄性不育系榆密15A相关文献:黄大军等，滇I型粳不育系榆密15A 的选育与应用研究，西南农业学报，2004，17(4): 535-537。
[0030] 3、滇I型细胞质雄性不育系H479A相关文献:程贤宇等，高原优质滇型杂交粳稻滇 禾优34高产制种技术，种子，2013,32(12):112-113。
[0031] 4、保持系合系42相关文献:刘吉新等，中日合作高原粳稻新品种的选育与推广，云 南农业科技，1998，（2):6-9。
[0032] 5、滇I型细胞质雄性不育系合系42A/(CT9993/称杆香糯）、保持系CT9993/称杆香 糯和保持系H479相关文献:苏家秀等，同核异质滇I型粳稻不育系及其保持系的光合特性， 作物学报，2011，37 (11): 2075-2084。
[0033] 6、保持系榆密15相关文献：陶光喜等，滇型杂交粳稻新组合滇杂33的选育与应用， 杂交水稻，2005,20(4)，16-17。
[0034] 2、DNA 提取
[0035] 米用改良的CTAB法（Rogers and Bendich,Extraction of DNA from milligram amounts of fresh,herbarium and mummified plant tissues,Plant Mol Biol,1985,5 (2) :69-76)提取水稻总DNA，4个滇I型细胞质雄性不育系和4个相应保持系各取约0.5g水稻 新鲜叶片分别放入到已编号（编号同表1样品来源表）的8个1.5mL离心管中，每个样品的均 按以下操作进行：
[0036] (1)在放入水稻新鲜叶片的1.5mL离心管中加入液氮并快速研磨成粉末状，待液氮 挥发完毕后加入2 X CTAB缓冲液700yL，放入65 °C水浴锅中lh，每隔20min混匀一次。
[0037] (2)取出离心管，10000 Xg，离心10min。取上清液至已编号的（编号同表1样品来源 表)1.5mL新离心管。
[0038] (3)在上清液中加入700yL氯仿异戊醇混合液，氯仿异戊醇混合液为三氯甲烷:异 戊醇(V/V) = 24:1，颠倒混勾至分层明显。10000 Xg，离心10min，取600μ1上清液移至已编号 (编号同表1样品来源表)的1.5mL新离心管。
[0039] (4)重复步骤(3)。
[0040] (5)在上清液中加入等体积预冷的异丙醇，将离心管轻轻颠倒混匀约lmin后，-20 °c冰箱中沉降lh。
[0041 ] (6)取出后，lOOOOXg，离心10min。弃上清液，白色沉淀用70%乙醇洗涤后再用 95%乙醇洗涤。
[0042] (7)风干后，加100yL已灭菌的双蒸水，现用或-20 °C冰箱保存。
[0043] 提DNA过程大约需3h。
[0044] 3、PCR 扩增
[0045] (1)引物序列来源及设计
[0046] 从已发表的文献中选取引物。atp6-〇rf 79和LD30来自文献：Luan et al .， Mitochondrial DNA genetic polymorphism in thirteen rice cytoplasmic male sterile lines，Plant Cell R印，2013,32(4) :545-554。全部引物由华大基因（BGI)合成。
[0047] (2)PCR 反应：
[0048] 将滇I型细胞质雄性不育系和相应保持系材料8个样品，每个样品分成两份，其中 一份用引物atp6-〇rf 79进行PCR扩增，另一份用引物LD30进行PCR扩增，详见如下操作：
[0049] A.引物atp6-〇rf79分别对滇I型细胞质雄性不育系和相应保持系材料共8个样品 进行PCR反应，每个样品PCR扩增反应体系总体积为25yL，其中Taq PCR Master Mix 12.5yL (购自北京博迈德公司），20pmo 1 /1上游引物atp6-〇rf 79F 0 · 25yL，20pmo 1 /L下游引物&七？6-orf79R 0.25yL，模板DNA lyL，无菌双蒸水IlyL。所述上游引物atp6-〇rf79F的碱基序列如 SEQ ID N0:1所示，下游引物atp6-〇rf79R的碱基序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，目标产 物片段长度为1592bp。
[0050] 按照上述配制完成8个样品atp6-〇rf79的PCR反应后，将PCR管放入Eppendorf PCR 仪中，设置引物atp6-〇rf 79的PCR反应程序进行如下反应:94 °C预变性4min，循环内94 °C变 性30s，55°C退火30s，72°C复性2min，30个循环后72°C延伸10min，耗时104min(每次可同时 检测96个样品）。
[0051 ] B.引物LD30分别对滇I型细胞质雄性不育系和相应保持系材料共8个样品进行PCR 反应，每个样品PCR扩增反应体系总体积为25yL，其中Taq PCR MasterMix 12.5yL(购自北 京博迈德公司），20pmol/L上游引物LD30F 0.25yL，20pmol/L下游引物LD30R 0.25yL，模板 DNA lyL，无菌双蒸水IlyL;所述上游引物LD30F的碱基序列如SEQ ID N0:3所示，下游引物 LD30R的碱基序列如SEQ ID N0:4所示，目标产物片段长度为788bp。
[0052] 按照上述配制完成8个样品LD30的PCR反应后，将PCR管放入Eppendorf PCR仪中， 设置引物atp6-〇rf 79的PCR反应程序进行如下反应:94°C预变性4min，循环内94°C变性30 s， 55°C退火30s，72°C复性2min，30个循环后72°C延伸10min，耗时104min(每次可同时检测96 个样品）。
[0053 ] (3)待滇I型细胞质雄性不育系和相应保持系材料共8个样品的2个引物的PCR反应 完成后，各取5yLPCR扩增产物，分别采用2%的琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭(EB)染色，在电压 120V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。
[0054] (4)特异引物在4个滇I型细胞质雄性不育系和4个相应保持系的电泳结果如图1， 结果可见，4个滇I型不育系中，特异引物atp6-〇rf79和LD30分别扩增出1592bp和788bp的单 一条带。4个保持系中，特异引物atp6-〇rf79和LD30均无扩增带。表明本发明方法能将滇I型 水稻细胞质雄性不育系和保持系快速、准确的鉴别出来。
[0055]由于两个引物的PCR反应条件相同，整个鉴别过程可在同一台PCR仪上同时进行 (可同时鉴别48个样品），其检测速度快，耗时约7h。
【主权项】
1. 鉴别滇I型水稻细胞质雄性不育系和保持系的特异引物，其特征在于:所述特异引物 由引物atp6-〇rf 79和引物LD30组成;所述引物atp6-〇rf 79由上游引物atp6-〇rf 79F和下游 引物atp6-〇rf79R组成，所述上游引物atp6-〇rf79F的碱基序列如SEQ ID N0:1所示，下游引 物atp6-〇rf79R的碱基序列如SEQ ID N0:2所示，目标产物片段长度为1592bp;所述引物 LD30由上游引物LD30F和下游引物LD30R组成，所述上游引物LD30F的碱基序列如SEQ ID N0:3所示，下游引物LD30R的碱基序列如SEQ ID N0:4所示，目标产物片段长度为788bp。2. 滇I型水稻细胞质雄性不育系和保持系的PCR鉴别方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 从水稻材料中提取DNA样品，每个DNA样品分为两份，一份用权利要求1中所述的引 物atp6-〇rf 79进行PCR反应，另一份用权利要求1中所述的引物LD30进行PCR反应； (2) PCR 反应： A. 引物atp6-〇rf79对每个DNA样品的PCR扩增反应体系总体积为25yL，其中Taq PCRMaster Mix 12.5yL，20pmol/L上游引物atp6-〇rf79F 0.25yL，20pmol/L下游引物&七口6-orf79R 0.25yL，模板DNA lyL，无菌双蒸水1 lyL;完成PCR反应后，放入EppendorfPCR仪中， 设置引物atp6-〇rf 79的PCR扩增程序为：94°C预变性4min，循环内94°C变性30s，55 °C退火 30s，72°C 复性 2min，30 个循环后 72°C 延伸 lOmin; B. 引物LD30对每个DNA样品的PCR扩增反应体系总体积为25yL，其中Taq PCRMaster Mix 12.5yL，20pmol/L上游引物LD30F 0.25yL，20pmol/L LD30R 0.25yL，模板DNA lyL，无 菌双蒸水1 lyL;完成PCR反应后，放入EppendorfPCR仪中，设置引物LD30的PCR扩增程序为： 94°C预变性4min，循环内94°C变性30s，55°C退火30s，72°C复性2min，30个循环后72°C延伸 lOmin； (3) 各取5yL PCR扩增产物，分别采用2%的琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色，在电压 120V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照； (4) 鉴别：同一样品分别用引物atp6-〇rf79和引物LD30分别扩增出1592bp和788bp单一 条带的，该样品为滇I型水稻细胞质雄性不育系；同一样品分别用引物atp6-〇rf79和引物 LD30分别扩增，均无扩增条带的，该样品为保持系。
【文档编号】C12N15/11GK105969886SQ201610479316
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】朱高倩, 谭学林, 陈丽娟, 谭亚玲, 徐津, 李娟 , 金寿林, 黄大军, 字秋艳, 郑玉珍, 闫诚强, 柳展, 姜珍珍
【申请人】云南农业大学