专利名称：一种牛体细胞克隆胚胎培养液及其培养方法
技术领域：
本发明涉及一种胚胎培养液及其培养方法，尤其涉及一种牛体细胞克隆胚胎培养 液及其培养方法。
背景技术：
体外生产胚胎必需经过一定时间的体外培养，筛选出质量好的胚胎才能移植到受 体子宫内，所以牛体细胞克隆胚胎的体外培养是获得体细胞克隆牛的关键环节之一。体内 发育的胚胎有母体生殖道分泌的各种未知细胞因子，而在体外培养时，必需人为补充各种 成分，因此只有体外培养环境十分接近体内输卵管和子宫内环境才能正常发育，以提高克 隆胚胎数量和质量以及产生健康后代。目前在市面上所出售的牛胚胎体外培养液为改良的输卵管培养液(mSOF) (Rorie R ff, Lester T D, Miller G F, et al. Effects of protein source and coculture on bovine embryo development in synthetic oviductal fluid medium[J]. Theriogenology, 1994,42 385 395)，其基本成分主要是 CaCl2 2H20、NaCL、KCL 以及 KH2P04 1. 3mmol/L等，牛体细胞克隆胚胎在38. 5°C,5% C02、饱和湿度等较为严格的条件 下，颗粒细胞单层上培养8天后才能筛选出胚胎移植到受体子宫内。尽管这样的培养液基 本能够满足体外培养所需要的条件，但这种配比或者这样的试剂的组合使得胚胎的8/16 细胞率、囊胚率、孵化率较低，某些重要基因表达水平也相对较低。研究发现，激活素A是TGF- 0超家族中的一员，是母-胎相互作用的一种潜在的 细胞因子，可促进颗粒细胞产生类固醇激素，能促进FSH诱导的芳香化酶作用，从而促进雌 激素的分泌。主要由子宫上皮细胞和子宫内膜细胞分泌，不但在胚胎早期发育中起着重要 作用，而且对胚胎的着床十分重要。激活素A —方面通过增加颗粒细胞FSH受体的水平增 加对FSH的反应；另一方面通过FSH刺激颗粒细胞产生更多的芳香化酶，从而促进雌激素的 分泌。目前国内外尚未发现有利用激活素A添加到输卵管培养液提高牛体细胞克隆胚胎的 8/16细胞率、囊胚率、孵化率等的开发报道，因此，建立一种新型的含有激活素A的牛体细 胞克隆胚胎培养液非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种牛体细胞克隆胚胎培养液，其提高了胚胎的8/16 细胞率、囊胚率、孵化率以及Na/K-ATPase、Glut-l、ActRII、Smad2等基因表达水平。本发明的技术解决方案是—种牛体细胞克隆胚胎培养液，包括市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液 (mSOF)，所述牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)包括1. 5 2. 5mmol/L的CaCl2 *2H20、 100 112mmol/L 的 NaCL、2. 5 4. 0mmol/L 的 KCL、1. 0 1. 5mmol/L 的 KH2P04 以及其余 量的水，其特殊支出在于还包括激活素A，所述激活素A的浓度是20 80ng/mL。上述牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)包括2mmol/L的CaCl2 2H20、107mmol/L 的 NaCL、3. 2mmol/L 的 KCL、1. 3mmol/L 的 KH2P04、20 80ng/mL 的激活素 A 以及 其余量的水。上述激活素A的浓度是40ng/mL最佳。上述激活素A是重组人激活素A或牛激活素A，一般为重组人激活素A，因为牛激 活素A—般难以取得。一种使用本发明的牛体细胞克隆胚胎培养液的培养方法，其特殊之处在于，该培 养方法包括1)选取牛体细胞颗粒细胞单层，在温度38. 5°C、含5% C02以及饱和湿度的培养条 件下，培养3天；2)从第4天开始，向市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)加入浓度为 20 80ng/mL的激活素A，得到权利要求1所述牛体细胞克隆胚胎培养液。3)再用权利要求1所述牛体细胞克隆胚胎培养液5天，即得牛体细胞克隆胚胎。 本发明所提供的培养液在使用时，培养液在培养条件是38. 5°C,5% C02、饱和湿度等常规培 养条件。上述前3天的培养不需换液。上述后5天的培养需隔天换液一次。上述激活素A向市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)加入之前需在温度 38. 5°C、含5% C02以及饱和湿度的条件下预热20 40分钟。上述激活素A向市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)加入之前需在温度 38. 5°C、含5% C02以及饱和湿度的条件下预热30分钟最佳。本发明的优点在于1、提高胚胎的8/16细胞率、囊胚率、孵化率。本发明在原有输卵管培养液(mSOF)的基础上进行改进，在其中添加了激活素A。 在牛胚胎体外培养时，胚胎发育一般阻滞于8-细胞期，这时正是母性基因调控向合子性基 因调控转换(MZT)的时期，对体外培养条件的要求更高。胚胎在母胎转换前主要是由卵母 细胞中的母体效应因子所控制，因此，激活素A作用不明显；而转换后激活素A促进了激素 和某些因子的分泌。因此，本发明在利用激活素A作用下发现胚胎的8/16细胞率、囊胚率 以及孵化率方面显著高于对照组。而且当培养液含有40ng/mL激活素A时，胚胎的8/16细 胞率、囊胚率、孵化率以及ICM/TE在数值上最高，分别为78. 0%,51. 6%,31. 8%以及25. 2。2、Na/K-ATPase、Glut_l、ActRII、Smad2 等基因表达水平显著提高。由于Na/K-ATPase调节着滋养层细胞内外Na+浓度，是调节囊胚腔形成的必 需因子之一；在发育正常的囊胚内Glut-1是上调的，如果下调将会导致囊胚细胞数 减少，甚至凋亡；ActRII和Smad2是激活素A细胞内信号传导的必需分子。本发明 在培养液中添加了激活素A，可使得基因Na/K-ATPase (0. 95 士 0. 3vs. 0. 42 士 0. 11)、 Glut-1 (1. 33 + 0. 31vs. 0. 61 + 0. 22)禾口 ActR II (1. 53 + 0. 21vs. 0. 60 + 0. 22), Smad2(l. 37士0. 22vs. 0. 55士0. 16)表达水平也明显提高。
具体实施例方式一种牛体细胞克隆胚胎培养液，包括市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液
4(mSOF)，所述牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)包括2mmol/L的CaCl2 2H20、 107mmol/L 的 NaCL、3. 2mmol/L 的 KCL、1. 3mmol/L 的 KH2P04、20 80ng/mL 的激活素 A 以及 其余量的水，实践证明激活素A的浓度是40ng/mL最佳。其中激活素A是重组人激活素A或牛激活素A，一般为重组人激活素A，因为牛激 活素A—般难以取得。一种使用本发明的牛体细胞克隆胚胎培养液的培养方法，该培养方法具体是1)选取牛体细胞颗粒细胞单层，在温度38. 5°C、含5% C02以及饱和湿度的培养条 件下，培养3天；2)从第4天开始，向市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)加入浓度为 20 80ng/mL的激活素A，得到上述牛体细胞克隆胚胎培养液，隔天换液一次；3)再用上述牛体细胞克隆胚胎培养液培养5天，即得牛体细胞克隆囊胚。本发明 所提供的培养液在使用时，培养液在培养条件是38. 5°C、5%C02、饱和湿度等常规培养条 件，需隔天换液一次。而且，激活素A向市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)加入之前需在温度 38. 5°C、含5% C02以及饱和湿度的条件下预热20 40分钟，一般预热30分钟最佳。在牛体细胞克隆胚两步培养法的技术体系上，本发明的发明人分析了添加激活素 A后囊胚形成率、囊胚细胞总数以及内细胞团(ICM)与饲养层细胞(TE)的比值，并从分子水 平检测胚胎孵化和着床相关基因(Na/K-ATPase和Glut-1)以及与激活素A信号通路紧密 相关的基因(ActR II和Smad2)表达水平的变化。表1后5天培养在含有激活素A的培养液中的囊胚内细胞团、滋养层及细胞总数 同一纵栏中不同的小写字母代表统计学上差异显著(P < 0. 05)本发明所提供的培养液在使用时，培养液在培养条件是38. 5°C,5% C02、饱和湿度 等常规培养条件。以及颗粒细胞单层上培养8天后就可能筛选出胚胎移植到受体子宫内。前3天 中在培养液不含激活素A，而从第4天开始一次性加入激活素A，使得培养液中激活素A为 20 80ng/mL，后5天的培养液含有激活素A，当激活素A的浓度是20 80ng/mL时，发现 胚胎的8/16细胞率、囊胚率以及孵化率方面显著高于对照组。
表2后5天培养在含有激活素A的培养液中的胚胎发育情况。 同一纵栏中不同的小写字母代表统计学上差异显著(P < 0. 05)。当培养液含有40ng/mL激活素A时，胚胎的8/16细胞率、囊胚率、孵化率 以及ICM/TE在数值上最高，分别为78.0 %、51.6 %、31.8 %、25.2。并且发现基因 Na/K-ATPase(0. 95 + 0. 3vs. 0. 42 + 0. 11)、Glut-1 (1. 33 + 0. 31vs. 0. 61 + 0. 22)禾口 ActRII (1. 53士0. 21vs. 0. 60士0. 22)、Smad2(l. 37士0. 22vs. 0. 55士0. 16)表达水平也明显 提高(注vs.前面的数值是加了激活素A后该基因的表达水平，vs.后面的是对照组该基 因的表达水平)。
权利要求
一种牛体细胞克隆胚胎培养液，包括市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)，所述牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)包括1.5～2.5mmol/L的CaCl2·2H2O、100～112mmol/L的NaCL、2.5～4.0mmol/L的KCL、1.0～1.5mmol/L的KH2PO4以及其余量的水，其特征在于还包括激活素A，所述激活素A的浓度是20～80ng/mL。
2.根据权利要求1所述的牛体细胞克隆胚胎培养液，其特征在于所述牛体细胞克隆 胚胎输卵管培养液(mSOF)包括 2mmol/L 的 CaCl2 · 2H20U07mmol/L 的 NaCL、3. 2mmol/L 的 KCL、1. 3mmol/L的KH2P04、20 80ng/mL的激活素A以及其余量的水。
3.根据权利要求1或2所述的牛体细胞克隆胚胎培养液，其特征在于激活素A的浓 度是 40ng/mL。
4.根据权利要求3所述的牛体细胞克隆胚胎培养液，其特征在于所述激活素A是重 组人激活素A或牛激活素A。
5.一种使用权利要求1所述牛体细胞克隆胚胎培养液的培养方法，其特征在于，该培 养方法包括1)选取牛体细胞颗粒细胞单层，在温度38.5°C、含5% CO2以及饱和湿度的培养条件 下，培养3天；2)从第4天开始，向市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)加入浓度为20 80ng/mL的激活素A，得到权利要求1所述牛体细胞克隆胚胎培养液。3)再用权利要求1所述牛体细胞克隆胚胎培养液5天，即得牛体细胞克隆胚胎。
6.根据权利要求5所述培养方法，其特征在于所述前3天的培养不需换液。
7.根据权利要求5所述培养方法，其特征在于所述后5天的培养隔天需换液一次。
8.根据权利要求5所述培养方法，其特征在于所述前3天不需换液，而后5天的培养 隔天均需换液一次。
9.根据权利要求8所述培养方法，其特征在于所述激活素A向市售牛体细胞克隆胚 胎输卵管培养液(mSOF)加入之前需在温度38. 5°C、含5% CO2以及饱和湿度的条件下预热 20 40分钟。
10.根据权利要求8所述培养方法，其特征在于所述激活素A向市售牛体细胞克隆胚 胎输卵管培养液(mSOF)加入之前需在温度38. 5°C、含5% CO2以及饱和湿度的条件下预热 30分钟。
全文摘要
一种牛体细胞克隆胚胎培养液及其培养方法，该培养液包括市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)，还包括激活素A，该激活素A的浓度是20～80ng/mL；其培养方法是用常规条件培养牛体细胞颗粒细胞单层3天，从第4天开始，向市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液(mSOF)加入浓度为20～80ng/mL的激活素A，得到牛体细胞克隆胚胎培养液，再用该牛体细胞克隆胚胎培养液5天既得牛体细胞克隆胚胎。本发明提高了胚胎的8/16细胞率、囊胚率、孵化率，使得Na/K-ATPase、Glut-1、ActR II、Smad2等基因表达水平显著提高。特别适用于牛体细胞克隆领域的应用。
文档编号A01K67/02GK101851602SQ200910021760
公开日2010年10月6日 申请日期2009年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者兰杰, 刘军, 刘永刚, 华松, 宋永利, 张涌, 王勇胜 申请人:西北农林科技大学