蓬乱蛋白作为脑卒中生物标志物的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学、生物领域，具体涉及蓬乱蛋白作为脑卒中诊断、罹患风险评估和 预后判断的生物标志物的用途。本发明还涉及蓬乱蛋白作为药物筛选的靶点用于筛选治疗 脑卒中的药物的用途。
【背景技术】
[0002] 从狭义上讲，生物标志物是指通过化学或生物方法检测血液或尿液来预测生理或 病理状态与疾病危险程度的一类指示剂。生物标志物是药物研发过程中的有效工具，它提 供了药物性能及疾病进程的相关信息，反映了具体的药物治疗效果。糖尿病及免疫性疾病 等多种疾病都已经根据生物标志物进行治疗。然而，在脑血管病中生物标志物仍相对缺乏。 而脑卒中是全球第三大高致死率、高致残率疾病 [1]，缺血性脑卒中是脑卒中的常见类型，严 重威胁人类健康[2]。因此，探索缺血性脑卒中的生物标志物有着重要的意义。
[0003] 蓬乱蛋白（disheveled,DVL)作为Wnt通路的调节蛋白，参与细胞内信号转导和 对其下游靶因子的转录过程，在细胞增殖、肿瘤形成、胚胎发育和神经分化等方面起重要作 用 [3'4]。DVL是由670个氨基酸残基组成的1种信号转导蛋白，在机体组织细胞中广泛表 达。DVL主要包括 3 个保守结构域：DIX(Dis/Axinhomologousdomain)、F*DZ(PSD-95 与 ZO-ldomain)和DEP，以及位于DIX和PDZ结构域之间的富含丝氨酸/苏氨酸区、位于H)Z 结构域下游的富含脯氨酸区以及位于DEP结构域下游的高度保守C-末端区[5]，不同结构域 分别与不同的信号蛋白结合来起到调节细胞的作用。但目前尚没有将DVL作为脑卒中生物 标志物的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的发明人经过反复摸索和大量实验，出人意料地发现蓬乱蛋白可以作为脑 卒中的生物标志物，用于脑卒中的诊断、罹患风险的评估和预后的判断等，由此完成了本发 明。
[0005] 本发明的第一方面涉及蓬乱蛋白或其活性片段、或者检测蓬乱蛋白或其活性片段 的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断脑卒中和/或评估罹患脑卒中的风 险。
[0006] 在本发明的一个实施方案中，其中所述的试剂盒是根据样品中蓬乱蛋白的含量或 含量的变化趋势来诊断脑卒中和/或评估罹患脑卒中的风险。
[0007] 在本发明的一个实施方案中，其中所述的样品为血液，例如选自血清、血浆和全 血。
[0008] 在本发明的一个实施方案中，所述的样品来源于哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠等。
[0009] 在本发明的实施方案中，当样品中蓬乱蛋白的含量降低或其含量低于正常值时， 表明受试者患有脑卒中，或者罹患脑卒中的风险高。
[0010] 在本发明的一个实施方案中，所述的脑卒中为缺血性脑卒中。
[0011] 本发明的第二方面涉及蓬乱蛋白或其活性片段、或者检测蓬乱蛋白或其活性片段 的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的 预后。
[0012] 在本发明的一个实施方案中，其中所述的试剂盒是根据样品中蓬乱蛋白的含量或 含量的变化趋势来评估脑卒中的治疗效果或者判断脑卒中的预后。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，其中所述的样品为血液，例如选自血清、血浆和全 血。
[0014] 在本发明的一个实施方案中，所述的样品来源于哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠等。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，当样品中蓬乱蛋白的含量升高时，表明脑卒中的治 疗有效或效果较好，或者表明脑卒中的预后较好。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，所述的脑卒中为缺血性脑卒中。
[0017] 本发明的第三方面涉及蓬乱蛋白或其活性片段、或者检测蓬乱蛋白或其活性片段 的物质用于筛选预防或治疗脑卒中的药物的用途或者在制备试剂盒中的用途，其中所述的 试剂盒用于筛选预防或治疗脑卒中的药物。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，其通过检测样品中蓬乱蛋白的含量或含量的变化趋 势来筛选治疗脑卒中的药物。
[0019] 在本发明的一个实施方案中，其中所述的样品为血液，例如选自血清、血浆和全 血。
[0020] 在本发明的一个实施方案中，所述的样品来源于哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠等。
[0021] 在本发明的一个实施方案中，蓬乱蛋白可以用为药物筛选的靶点，用于筛选预防 或治疗脑卒中的药物。当施用药物后样品中蓬乱蛋白的水平升高时，表明该药物可以作为 预防或治疗脑卒中的药物。
[0022] 在本发明的一个实施方案中，所述的脑卒中为缺血性脑卒中。
[0023] 本发明的第四方面涉及能够提高血液中蓬乱蛋白含量的物质用于制备预防或治 疗脑卒中的药物的用途。
[0024] 在本发明的一个实施方案中，其中所述血液选自血清、血浆和全血。
[0025] 在本发明的一个实施方案中，所述的样品来源于哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠等。
[0026] 在本发明的实施方案中，能够提高血液中蓬乱蛋白含量的物质可以是任何物质， 例如小分子化合物、生物大分子例如蛋白质（如抗体、配体）、多肽或核酸等，该物质可以通 过与蓬乱蛋白的直接作用或间接作用来提高血液中蓬乱蛋白的含量。
[0027] 在本发明的一个实施方案中，所述能够提高血液中蓬乱蛋白含量的物质为莫诺 苷。
[0028] 在本发明的一个实施方案中，所述的脑卒中为缺血性脑卒中。
[0029] 在本发明中，所述脑卒中是指由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞造成血液循环 障碍而引起脑组织损伤的一组疾病。在本发明的实施方案中，所述脑卒中为缺血性脑卒中， 所述缺血性脑卒中是指因脑部血液循环障碍（例如颈内动脉、颈外动脉、椎动脉、大脑中动 脉因狭窄或闭塞引起的循环障碍），缺血、缺氧所致的局灶性脑组织缺血性坏死或软化的总 称，其是脑卒中的主要类型，占脑卒中的60 %~70%。
[0030] 在本发明中，所述蓬乱蛋白来源于哺乳动物，特别是人，其序列例如为AAH17225. 1 所示。所述蓬乱蛋白的活性片段是指具有蓬乱蛋白功能的片段，或者降解后可以在血液中 检测到的片段，其可以为蓬乱蛋白的一部分，也可以为蓬乱蛋白的氨基酸序列经过缺失、添 加或替换后得到的片段；例如该活性片段为包含蓬乱蛋白与配体或受体结合的部分的片 段，或者经过氨基酸的缺失、添加或替换后仍保留蓬乱蛋白功能的片段。
[0031] 在本发明中，所述检测蓬乱蛋白或其活性片段的物质为本领域所公知，或者其制 备方法或获得方法为本领域所公知，通常情况下，其可以和蓬乱蛋白或其活性片段特异性 结合，通过检测该物质即可以检测蓬乱蛋白或其活性片段的存在或含量，例如其可以为哺 乳动物体内天然存在的可以与蓬乱蛋白或其活性片段结合的配体、受体或抗体，也可以为 本领域技术人员制备的能够和蓬乱蛋白特异性结合的抗体，例如为单克隆抗体或多克隆抗 体。在本发明的实施方案中，所述检测蓬乱蛋白或其活性片段的物质为多克隆抗体，其结合 位点位于人Dvl蛋白的第1-100位氨基酸之间。
[0032] 发明的有益效果
[0033] 本发明通过实验证明了蓬乱蛋白可以作为脑卒中的生物标志物，用于脑卒中的诊 断、罹患风险的评估和预后的判断；同时，蓬乱蛋白还可以作为筛选药物的靶点，用于筛选 预防或治疗脑卒中的药物。
【附图说明】
[0034] 图1.造模后不同时间点各组大鼠血清DVL蛋白的表达情况，n= 4; *p〈0.05，* *p〈0.01，与假手术组相比。
[0035] 图2.造模后第7天各组大鼠血清DVL蛋白的表达情况，n= 4，〃p〈0. 001，与假 手术组相比；_P〈〇. 001，与模型组相比。
[0036] 图3.LudmilaBelayev12分评分法结果，+〃p〈0. 001与假手术组相比； p〈0. 001，与模型组相比。
[0037] 图4.莫诺苷对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑梗死体积MIR检测结果，mp〈0. 001 与假手术组相比；##P〈〇. 01，与模型组相比。
【具体实施方式】
[0038] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0039] 实施例1DVL可以作为脑卒中的生物标志物
[0040] 1材料与方法
[0041] 1. 1实验动物
[0042] SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠20只，7-8周龄，质量为260_280g。购自斯贝福 实验动物科技有限公司，合格证编号：SCKK(京）2011-0004。常规饲养，环境温度24± 1°C， 湿度55±5%，术前12h禁食不禁水。
[0043] 1. 2 药物
[0044] 莫诺苷由宣武医院药物研究室自行从山茱萸中提取制备，高效液相色谱分析纯度 98. 5%，临用前用蒸馏水溶解成所需浓度的药液供实验用。
[0045] 中药山茱萸为山茱萸科植物山茱萸（CornusofficinalisSieb.etZucc.)的干 燥成熟果实。宣武医院药物研究室对其有效成分山茱萸环烯醚萜苷进行进一步分离，得到 单体化合物莫诺苷。我们的前期研究发现，莫诺苷能减小局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死 体积，增强皮层抗氧化、抗炎和抗凋亡能力 [6 8]，并促进内源性的神经干细胞增殖[9]，改善神 经功能。此外，莫诺苷在缺血初期调节血脑屏障的通透性，促进血脑屏障重构，在缺血后期 使内皮祖细胞增殖增强，促进血管新