生，最终改善微血管功能整体性 [1°]。莫诺苷的结构如 下所示：
[0046]
[0047] 1. 3试剂和仪器
[0048] 兔源性Dvl多克隆抗体（abl06844)、鼠源性Tubulin单克隆抗体（ab56676):美国 abeam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（ZB-2301)、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠 二抗（ZB-2010):北京市中杉金桥生物技术有限公司；RIPA裂解液（P0013B):碧云天生物 技术研究所；BCA法蛋白定量试剂盒（P1511):北京普利莱基因技术有限公司；ECLWestern BlottingKit(32109):美国THERMO-PIERCE公司。
[0049]台式微量冷冻离心机（BeckmanCoulter公司，美国）；PowerpacBasic(Bio-Rad 公司，美国）；化学发光凝胶成像系统（ProteinSimple公司，美国）；全波长酶标仪（Thermo Fisher公司，美国）。
[0050] 1.4实验方法
[0051] 1. 4. 1局灶性脑缺血再灌注大鼠模型制备
[0052] 参照Longa线栓法[11]制备大鼠大脑中动脉阻塞（middlecerebralartery 〇(^1118；1〇11，]\^^\0)模型。3。抑8116-〇3￥167雄性大鼠手术前禁食12小时。10%水合氯醛41111/ kg进行腹腔注射麻醉。将麻醉后的大鼠仰卧置于手术操作台上，用安尔碘进行颈部周围消 毒。在大鼠颈部正中切口约2cm，对肌肉及筋膜进行分离，注意避开甲状腺。当气管右侧 及胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌之间的三角区暴露后，继续钝性分离出右侧颈总动脉（Common carotidartery，CCA)、颈内动脉（Internalcarotidartery，ICA)和颈外动脉（External carotidartery，ECA)。结扎ECA接近分叉处及CCA近心端，用动脉夹夹闭ICA，在CCA用 眼科剪剪一个斜行的细小切口，将栓线小心插入，缓慢轻推栓线进入ICA，直到产生阻挡 感，说明栓线已经经过CCA分叉处，通过ICA入颜进入了大脑中动脉（middlecerebral artery,MCA)，到达了大脑前动脉（anteriorcerebralartery,ACA)起始部，阻断MCA的所 有血供，造成了大脑中动脉阻塞。此时不再推入栓线，以免扎破血管造成蛛网膜下腔出血。 将栓线与CCA-并结扎，松开动脉夹，记录栓塞开始时间。缝合肌肉，并在创口处涂少量青 霉素，以预防伤口感染。栓塞30min后，用眼科镊缓慢向外拔出栓线，实现再灌注。假手术 组麻醉后进行相同手术操作，但不插栓线。MCAO手术以后注意保温，大鼠麻醉未醒之前置于 温控毯上。
[0053] 1.4.2分组与给药
[0054] 大鼠清醒后，参照Zealonga5分法进行神经功能损伤评分[12]，1分：提鼠尾离开 地面约33cm，不能充分伸展对侧前肢；2分：提鼠尾离开地面约33cm，对侧前肢屈曲；3分： 将大鼠置于地面，向对侧行走；4分：将大鼠置于地面，向对侧转圈，呈追尾状；5分：损伤严 重，对侧肢体瘫痪。剔除1分和5分的大鼠，完成神经功能损伤评分并符合实验要求的动 物，根据评分高低，随机分为假手术组，模型后Id组，模型后3d组，模型后7d组，莫诺苷 (270mg/kg)组，每组4只。造模3h后，莫诺苷组连续灌胃给药7d，每天给药1次，假手术组 和模型组给予等量的生理盐水。
[0055] 1. 4. 3Westernblotting分析血清中DVL蛋白表达
[0056] 各组取材前，将大鼠用10%水合氯醛3. 5ml/kg腹腔麻醉，从腹主动脉取血5-6mL， 置于4°C冰箱保存2h，以4°C4000r/min离心15min，取上清液，于-20°C保存。取已制备好 的血清，冻融后，用0.22ym的滤膜过滤3次后用蒸馏水稀释200倍。取稀释好的血清测 定蛋白浓度，总蛋白与5X上样缓冲液1:4稀释，95°C变性lOmin。
[0057]DVL采用10 %SDS-PAGE分离胶，浓缩胶用5 %SDS-PAGE。电泳：浓缩胶电压60V， 40min，分离胶电压90V，90min，分离蛋白。电泳后用0. 45ymNC膜进行转膜；条带在5%的脱 脂奶粉中封闭2h;分别用兔多克隆DVL抗体（1:1000)、小鼠单克隆Tubulin抗体（1:2000) 和，4°C冰箱孵育过夜。TBST缓冲液洗涤3次，每次lOmin。接下来与相应的辣根过氧化物 酶（HRP)结合的二抗室温孵育2h，TBST缓冲液洗涤3次，每次lOmin;用ECL显色lmin，滤 去显色液，凝胶成像仪拍片。用QuanityOne软件对蛋白条带进行恢复分析。
[0058] 1.5统计学分析
[0059] 实验数据采用SPSS13. 0统计学软件进行统计处理，结果以Mean土SEM表示。组 间样本均数比较用单因素方差分析（one-wayanalysisofvariance,AN0VA)，以p〈0. 05表 示有统计学意义。
[0060] 2.结果
[0061] 2. 1Westernblotting观察大鼠脑缺血再灌注后不同时间点DVL蛋白表达变化
[0062] 如图1所示，造模后ld，模型组血清DVL蛋白表达量明显降低（P〈0. 05);造模后3d 和7d模型组血清DVL蛋白表达量显著降低（P〈0. 01)。
[0063] 2. 2Westernblotting观察莫诺苷对缺血性脑损伤后DVL表达的影响
[0064] 如图2所示，造模7d后，模型组血清DVL蛋白显著降低（P〈0.001)，与模型组相比， 莫诺苷（270mg/kg)组DVL表达水平显著升高（P〈0.001)。
[0065] 3.莫诺苷促进神经功能恢复减少梗死面积
[0066] 3. 1材料与方法
[0067]3. 1. 1实验动物
[0068]SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠，7-8周龄，质量为260_280g。购自北京维通利华 实验动物技术有限公司，合格证编号：SCKK(京）2007-0001。常规饲养，环境温度24±1°C， 湿度55±5%，术前12h禁食不禁水。
[0069] 3. 1. 2 药物
[0070] 莫诺苷由宣武医院药物研究室自行从山茱萸中提取制备，高效液相色谱分析纯度 98. 5%，临用前用蒸馏水溶解成所需浓度的药液供实验用。
[0071] 3. 1.3试剂和仪器
[0072] 10%水合氯醛，宣武医院制剂室。
[0073] 尼龙栓线（批号：2632-100,d=0? 26mm，北京沙东生物技术有限公司）；核磁共振 扫描仪3.OTesla成像系统（飞利浦）。
[0074] 3.2实验方法
[0075] 3. 2. 1局灶性脑缺血再灌注大鼠模型制备
[0076] 参照Longa线栓法[11]制备大鼠大脑中动脉阻塞（middlecerebralartery 〇(^1118；1〇11，]\^^\0)模型。3。抑8116-〇3￥167雄性大鼠手术前禁食12小时。10%水合氯醛41111/ kg进行腹腔注射麻醉。将麻醉后的大鼠仰卧置于手术操作台上，用安尔碘进行颈部周围消 毒。在大鼠颈部正中切口约2cm，对肌肉及筋膜进行分离，注意避开甲状腺。当气管右侧 及胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌之间的三角区暴露后，继续钝性分离出右侧颈总动脉（Common carotidartery，CCA)、颈内动脉（Internalcarotidartery，ICA)和颈外动脉（External carotidartery，ECA)。结扎ECA接近分叉处及CCA近心端，用动脉夹夹闭ICA，在CCA用 眼科剪剪一个斜行的细小切口，将栓线小心插入，缓慢轻推栓线进入ICA，直到产生阻挡 感，说明栓线已经经过CCA分叉处，通过ICA入颜进入了大脑中动脉（middlecerebral artery,MCA)，到达了大脑前动脉（anteriorcerebralartery,ACA)起始部，阻断MCA的所 有血供，造成了大脑中动脉阻塞。此时不再推入栓线，以免扎破血管造成蛛网膜下腔出血。 将栓线与CCA-并结扎，松开动脉夹，记录栓塞开始时间。缝合肌肉，并在创口处涂少量青 霉素，以预防伤口感染。栓塞30min后，用眼科镊缓慢向外拔出栓线，实现再灌注。假手术 组麻醉后进行相同手术操作，但不插栓线。MCA0手术以后注意保温，大鼠麻醉未醒之前置于 温控毯上。
[0077] 3. 2. 2大鼠神经功能学评分
[0078]大鼠清醒后，参照LudmilaBelayev12 分评分法（LudmilaBelayev'smethod) [13'14]，提尾悬空（2分）0分：无明显神经功能缺失；1分：梗死对侧肢体轻度屈曲；2分：梗死 对侧肢体屈曲明显。肢体放置，分为视觉亚试验（前方、侧方）和触觉亚试验（前方、侧方） (8分）0分：动物肢体放置反应正常；1分：反应延迟但不超过2s;2分：反应延迟且>2s。本 体觉亚试验（2分）0分：与对侧比肢体同样有力；1分：与对侧比肢体稍有力；2分：与对侧 比肢体无力。完成神经功能损伤评分并符合实验要求的动物，根据评分高低，随机分为假手 术组，模型组，莫诺苷（270mg/kg)组，每组14只。术后3h后，莫诺苷组连续灌胃给药7d，每 天给药1次，假手术组和模型组给予等量的生理盐水。
[0079] 3. 2. 3MRI检测莫诺苷对大鼠缺血后脑梗死体积的影响
[0080] 缺血后7天，各组动物进行磁共振检查，采用PhilipsGyroscanIntera3. 0T超 导磁共振仪。大鼠麻醉后，取仰卧位头部固定于自制有机玻璃板上，鼠头置C3环形