专利名称：新颖的天冬酰胺酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖蛋白及编码所述蛋白的多核苷酸序列。更具体地，本发明涉及具有天冬酰胺酶活性的蛋白和使用这些蛋白的方法。
发明背景
近来,公开了丙烯酰胺在很多经加热食物产品中出现(Tareke et al. Chem. Res. Toxicol. 13，517-522 (2000))。鉴于丙烯酰胺被认为可能对动物和人致癌，该发现产生了世界范围的关注。进一步的研究揭示，在多种经烘焙、煎炸和烤箱制备的常见食物中可检测到相当含量的丙烯酰胺，并且显示，食物中丙烯酰胺的出现是加热过程的结果。Mottram et al. Nature419 :448(2002)已提出了作为Maillard反应的结果从氨基酸和还原糖形成丙烯酰胺的途径。根据该假说，丙烯酰胺可在Maillard反应期间形成。在烘焙和烘烤 (roasting)期间,Maillard反应负责颜色、气味和味道。与Maillard相关的反应是氨基酸的Strecker降解，提出了形成丙烯酰胺的途径。当温度超过120°C，可检测到丙烯酰胺的形成，在170°C左右观察到了最高的形成速率。当存在天冬酰胺和葡萄糖时，可观察到最高的丙烯酰胺水平，而谷氨酰胺和天冬氨酸仅导致痕量丙烯酰胺。
EU中针对丙烯酰胺从食物接触的塑料迁移进食物的官方迁移限制被设置为 IOppb(每kg 10微克)。虽然对烹饪期间形成的丙烯酰胺尚没设置官方限制，但是很多产品(尤其是谷物类、面包产品和基于马铃薯或玉米的产品)超过该值这一事实导致了人们的关注。
已知若干植物原材料含有大量水平的天冬酰胺。在马铃薯中，天冬酰胺是主要的游离氨基酸(940mg/kg，对应总氨基酸含量的40% )，在小麦面粉中，天冬酰胺以大约167mg/kg的水平存在，对应于总游离氨基酸的14% (Belitz and Grosch in Food Chemistry-Springer New York, 1999)。丙烯酰胺主要从天冬酰胺(组合还原糖)形成，这一事实可解释经煎炸、烤箱烹饪或烘烤的植物产品中丙烯酰胺的高水平。因此，就公众健康方面而言，急切需要具有低得多的丙烯酰胺水平，或者优选全无丙烯酰胺的食物产品。
已经提出了多种减少丙烯酰胺含量的解决方案，或者通过改变加工变量，例如，力口热步骤的温度或持续时间，或者通过化学方式或酶促方式防止丙烯酰胺形成或者通过除去形成的丙烯酰胺来实现。
在若干专利中请中，已经公开了天冬酰胺酶用于减少天冬酰胺水平以及由此减少形成的丙烯酰胺的量的用途。已从若干种真菌来源产生了用于该目的的合适的天冬酰胺酶，例如，从 Aspergillus niger (W02004/030468 中)和 AspergiIIus oryzae (W004/032648 中)。
虽然所有L-天冬酰胺酶都催化同样的化学转化，但这并不意味着它们适合用于同样的应用。多种不同的应用对酶操作的必要条件提出了不同的要求。可能影响到酶促转化速率的物理和化学参数是温度(对化学反应速率有正面影响，但是可能对酶稳定性有负面影响)、水分含量、pH、盐浓度、食物基质的结构完整性、酶的活化剂或抑制剂的存在、底物和产物的浓度等。因此，人们正需要改进的天冬酰胺酶，其具有改进的性质适于多种应用。
发明详沭
本发明涉及展示天冬酰胺酶活性并显示下述比活性的多肽(i)在37°C的温度下在pH 5和pH 8之间的pH下,是SEQ ID NO : I的A. niger野生型天冬酰胺酶的比活性的至少两倍，和Qi)其在PH 5、pH 6和pH 7下比在这些pH值下的来自WO 2008/128974的变体天冬酰胺酶ASN02 (在本专利申请的SEQ ID NO 20中描绘并对应于W02008/128974中的SEQ IDNO 5)的比活性至少高10%。此类蛋白具有在SEQ ID NO. I的位置63上的天冬氨酸、甘氨酸或组氨酸和在位置88上的丝氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸，SEQ ID NO. I是如在WO 04/030468中公布的A. niger野生型天冬酰胺酶的序列。优选地该多肽与在SEQ ID NO 1 中描绘的野生型A. niger天冬酰胺酶具有至少90%、优选地至少95%的同一'丨生程度(％同一 I"生)。
术语“ 同源性”或“百分比同一性”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言， 在此定义为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，本着最优比较的目的 (例如，可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的比对)，将所述序列进行比对。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一条序列上的位置被与第二条序列中相应位置处相同的氨基酸或核苷酸残基占据，那么这两条分子在该位置是相同的。两条序列间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，％同一性=相同位置的数量/位置 (即重叠位置)总数X100)。优选地，两条序列长度相同。
可在被比较的两条序列全长上或两条序列片段上进行序列比较。典型地，在被比较的两条序列的全长上进行比较。但是，可在例如二十个、五十个、一百个或更多个相邻的氨基酸残基的区域上确定序列同一性。
技术人员将知道，有若干计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成对序列的比对和对两条序列间百分比同一性的确定。在一种优选的实施方式中，使用 Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48) :444-453 (1970))算法来确定两条氨基酸序列间的百分比同一'I"生，所述算法已被加入到GCG软件包(可从http://www. gcg. com MU )的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员将知道，所有这些不同的参数将导致有细微区别的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体百分比同一性不会有显著改变。
本发明的核酸和蛋白序列还可被用作“查询序列”来开展对公众数据库的搜索，例如，以鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10的BLASTN和BLASTX程序(2. O版)来开展此类搜索。可以用BLASTP程序，以分数=50，字长=3来进行此类BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的，为获得有缺口的比对，可以利用Altschul et al.，(1997) Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402 中描述的 Gapped BLAST。当利用 BLAST 和 Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTP和BLASTN)的缺省参数。见http://www. ncbi. nlm. nih. gov。
本发明的蛋白的一个优势是，它们在中性、酸性和碱性pH下展示具有高比活性的天冬酰胺酶活性(EC 3. 5. I. I)。在一些实施方式中，在这些pH值下，比活性比野生型天冬酰胺酶的比活性高超过6倍(pH 7)或超过30倍(pH 8)。
在本发明中，术语“比活性”是指以单位/(mg天冬酰胺酶蛋白)测量的天冬酰胺酶活性。
根据本发明的蛋白可以任何合适的方式获得。在一种实施方式中，通过修饰天冬酰胺酶获得所述蛋白。用于修饰的合适的天冬酰胺酶可从各种来源中获得，所述来源例如来自植物、动物或微生物。例如，天冬酰胺酶可从Escherichia、Erwinia、Streptomyces、 Pseudomonas> Aspergillus 和 Bacillus 种中获得。合适的 Escherichia 菌株的例子是 Escherichia coli。合适的 Erwinia 菌株的例子是 Erwinia chrysanthemi。合适的 Streptomyces 菌株的例子是 Streptomyces Iividans 和 Streptomyces murinus。 合适的 Aspergillus 菌株的例子是 Aspergillus oryzae> Aspergillus nidulans 或 Aspergillus niger。合适的 Bacillus 菌株的例子是 Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、BaciIluscoaguIans> Bacillus lautus> Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、BaciIlusmegaterium> Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis 或 BaciIlusthurigiensis.
适于从BaciIIus、Streptomyces、Escherichia 或 Pseudomonas 菌株获得天冬酸胺酶的方法的例子在WO 03/083043中描述。适于从Aspergillus获得天冬酰胺酶的方法的例子在 WO 2004/030468 和 WO 04/032648 中描述。
用于修饰以获得根据本发明的蛋白的优选的天冬酰胺酶是具有在SEQID NO 1中展示的序列的天冬酰胺酶。
在一种实施方式中，根据本发明的蛋白SI具有根据SEQ ID NO. 2的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378、17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、 25-378或26-378的所述序列的一部分。取决于使用的具体宿主和培养条件，归因于信号序列的处理和可能的进一步截短，可产生这些变化形式。在该实施方式中，较之SEQ ID NO. I, 在位置16的Ser被Ala替代、在位置63的As·p被Gly替代、在位置132的Gly被Ser替代且在位置293的Ala被Val替代。
在另一实施方式中，根据本发明的蛋白S2具有根据SEQ ID NO. 3的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378、17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、 25-378或26-378的所述序列的一部分。在该实施方式中，较之SEQ ID NO. 1，在位置41的 Thr被Ile替代、在位置63的Asp被Gly替代、在位置88的Ser被Val替代、在位置111的 Asp被Gly替代且在位置122的Arg被His替代。
在另一实施方式中，根据本发明的蛋白S3具有根据SEQ ID NO. 4的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378、17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、 25-378或26-378的所述序列的一部分。在该实施方式中，较之SEQ ID NO. 1，在位置41的 Thr被Ile替代、在位置63的Asp被Gly替代且在位置88的Ser被Phe替代。
在另一实施方式中，根据本发明的蛋白S4具有根据SEQ ID NO. 5的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378、17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、 25-378或26-378的所述序列的一部分。在该实施方式中，较之SEQ ID NO. 1，在位置63的 Asp被His替代、在位置76的Ala被Thr替代、在位置77的Val被Phe替代、在位置101的 Ala被Val替代且在位置170的Ala被Thr替代。
在另一实施方式中，根据本发明的蛋白S5具有根据SEQ ID NO. 6的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378、17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、 25-378或26-378的所述序列的一部分。在该实施方式中，较之SEQ ID NO. 1，在位置17的 Ala被Thr替代、在位置63的Asp被Gly替代、在位置119的Lys被Asn替代、在位置262 的Arg被Cys替代。
在另一实施方式中，根据本发明的蛋白S6具有根据SEQ ID NO. 7的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378、17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、 25-378或26-378的所述序列的一部分。在该实施方式中，较之SEQ ID NO. 1，在位置41的 Thr被Ile替代、在位置66的Ser被Pro替代、在位置88的Ser被Val替代、在位置244的 Val被Ala替代且在位置262的Arg被Cys替代。
在另一实施方式中，根据本发明的蛋白S7具有根据SEQ ID NO. 8的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378、17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、 25-378或26-378的所述序列的一部分。在该实施方式中，较之SEQ ID NO. 1，在位置63的 Asp被His替代、在位置76的Ala被Thr替代、在位置77的Val被Phe替代、在位置101的 Ala被Val替代、在位置111的Asp被Gly替代、在位置161的Ile被Leu替代、在位置170 的Ala被Thr替代、在位置244的Val被Ala替代且在位置371的Val被Met替代。
在另一实施方式中，根据本发明的蛋白S8具有根据SEQ ID NO. 9的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378、17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、 25-378或26-378的所述序列的一部分。在该实施方式中，较之SEQ ID NO. 1，在位置16的 Ser被Ala替代、在位置63的Asp被Gly替代、在位置76的Ala被Thr替代且在位置119 的Lys被Asn替代。
在另一实施方式中，根据本发明的蛋白S9具有根据SEQ ID NO. 10的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378，17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、 25-378或26-378的所述序列的一部分。在该实施方式中，较之SEQ ID NO. 1，在位置28的 Glu被Gly替代、在位置33的Thr被Ala替代且在位置63的Asp被His替代。
在另一实施方式中，通过编码根据本发明的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的表达，获得根据本发明的蛋白。因此，在另一方面中，本发明涉及具有编码根据本发明的多肽的核苷酸序列的核酸分子。编码根据本发明的蛋白的核苷酸序列的一个例子在SEQ ID NO. 11 (编码SI)中给出。编码根据本发明的蛋白的其他DNA序列在SEQ ID NO. 12(编码 S2)、SEQ IDN0. 13 (编码 S3)、SEQ ID NO. 14 (编码 S4)、SEQ ID NO. 15 (编码 S5)、SEQ ID NO. 16 (编码 S6)、SEQ ID NO. 17 (编码 S7)、SEQ ID NO. 18 (编码 S8)和 SEQ ID NO. 19 (编码S9)中给出。
或者，可使用简并核苷酸序列。用于合成简并核苷酸序列的方法是本领域中已知的(参见，例如，Narang(1983) Tetrahedron 39 3 ；ltakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53 323 ；ltakura et al. (1984)Science 198 :1056 ;Ikeet al. (1983)Nucleic Acid Res. 11 :477)。
可使用对本领域技术人员而言熟知的标准分子生物学技术，产生根据本发明的核酸分子。例如，使用标准合成技术，所需的核酸分子可重新(de novo)合成。典型地，这种合成方法是自动化的方法。
或者，可通过使用对本领域技术人员而言熟知的其他方法，产生本发明的核酸分子。
以这种方式得到的核酸分子可被克隆进适当的载体中并通过DNA序列分析表征。
因此，在另一方面中，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的核苷酸构建体。在一种实施方式中，根据本发明的核苷酸构建体是载体，比如克隆载体或表达载体。载体可以是原核的或真核的，但优选地是真核载体。在另一实施方式中，根据本发明的核苷酸构建体是质粒。例如，在原核或真核宿主中自主复制的质粒。
载体或质粒典型地包含与将要表达的核酸序列可操作地连接的一种或多种调控序列以允许序列在具体宿主中表达。此种调控序列包括启动子、增强子和本领域中已知的其他表达控制兀件。见例如 Goeddel ;GeneExpression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA (1990)。本领域技术人员将意识到，表达载体的设计取决于这样的因素，比如将被转化的宿主细胞的选择和期望的蛋白的表达水平。 合适的启动子对技术人员而言是已知的。在一种具体的实施方式中，能够指导天冬酰胺酶在丝状真菌中的高表达水平的启动子是优选的。此类启动子是本领域中已知的。表达构建体可含有转录起始、终止的位点和用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录本的编码部分包括处于起点的用于起始翻译的AUG以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码。为使翻译的蛋白能分泌到内质网的腔、胞质间隙或胞外环境中，可以将适当的分泌信号插入到编码蛋白的编码序列中。
载体或质粒典型地还含有一种或多种选择性标记物。优选的选择性标记物包括赋予对药物(比如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)抗性的那些。核酸编码选择性标记物可在与编码根据本发明的蛋白的相同载体上被引入宿主细胞或可在分开的载体上被引入宿主细胞。 被引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择而被鉴定出。
可用于本发明的表达载体包括源自染色体、游离体和病毒的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体、酵母游离体、酵母染色体元件的载体，源自病毒，例如杆状病毒、乳头多瘤空泡病毒(papova virus)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒的载体和源自上述物质的组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体,例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。
可通过常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞。在本文中使用时， 术语“转化”和“转染”意图表示将外源核酸(例如，DNA)引入宿主细胞的各种本领域内公认的技术。转化或转染宿主细胞的合适的方法，见Sambrook等人的(Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd，ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press， ColdSpring Harbor， NY,1989), Davis et al. ， Basic Methods in Molecular Biology(1986)和其他实验手册。
反义于根据本发明的核酸分子的核酸分子也包括在本发明中。
在另一方面中，本发明涉及用根据本发明的核苷酸构建体转化的细胞，所述细胞因而作为宿主细胞。原核和真核细胞二者比如细菌、真菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，都可作为宿主细胞。合适的例子包括细菌细胞，例如E. coli、Streptomyces、Salmonella typhimurium和某些Bacillus的种；真菌细胞，例如Aspergillus的种，例如A. niger、 A. oryzae 和 A. nidulans，例如酵母，例如 Kluyveromyces，例如 K. Iactis 和 / 或 Puchia,例如 P. pastoris ；昆虫细胞，例如 Drosophila S2 和 Spodoptera Sf9 ;动物细胞，例如 CH0、 VER0、BHK、HeLa、3T3和COS ;以及植物细胞。特别优选的细胞是来自丝状真菌、特别是来自 Aspergillus niger的细胞。针对上述宿主细胞的适当的培养基和培养条件是本领域中已知的。
可以对宿主细胞加以选择，选出能调节插入序列表达的宿主细胞或能以特异性的、令人期待的方式对基因产物进行修饰或加工的宿主细胞。对蛋白产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可以促进被编码的蛋白的最优机能。
在另一方面中，本发明涉及根据本发明的蛋白在食品工业中的用途。在一种实施方式中，本发明的蛋白方便地用来防止或减少丙烯酰胺在基于含天冬酰胺的原材料的食物产品特别是热加工食物产品中形成。例如，该蛋白用于下述生产食物产品的工艺中，所述工艺涉及至少一个加热步骤，包括将一种或多种天冬酰胺酶加入食物产品的中间产物形式中，由此在加热步骤之前将酶以能有效降低食物产品的中间产物形式中存在的天冬酰胺酶的水平的量加入。此类工艺被公开于W004/030468中，所述工艺及其所有优选级通过引用并入本文。W004/026043中还描述了其中可使用根据本发明的蛋白的合适工艺。 W004/026043中公开的方法及其所有优选级通过引用并入本文。
食物产品的中间产物形式在本文中被定义为生产工艺期间在获得食物产品的最终形式之前出现的任何形式。中间产物形式可包含使用的各原材料和/或其混合物和/或与添加剂和/或加工助剂的混合物或其经随后加工的形式。例如，对于食物产品面包来说， 中间产物形式包含，例如，小麦、小麦面粉、其与其它面包成分(例如水、盐、酵母和面包改进组合物)的最初混合物、混合面团、经捏练的面团、经发酵的面团和经部分烘焙的面团。 例如，对于若干种基于马铃薯的产品而言，脱水马铃薯片或颗粒是中间产物，对玉米脆片而 H，玉米糊是中间广物。
食物产品可以从至少一种植物来源(例如马铃薯、烟草、咖啡、可可、水稻、谷物， 例如小麦、裸麦、玉米、大麦、燕麦粒(groats)、荞麦和燕麦)的原材料制得。在本发明上下文中，术语“小麦”包括!'!■;[1:;[(3111]1属的所有已知种,例如,36 81:;^11111、(111；1011]1和/或spelta。从超过一种原材料或中间产物制得的食物产品也包括在本发明的范围内，例如包括小麦(面粉和/或淀粉)和马铃薯二者的食物产品。
根据本发明的工艺可应用的食物产品的例子是任何基于面粉的产品，例如，面包、 法棍面包、炸面包圈、面包卷、脆饼、糕点、蛋糕、脆饼、百吉圈、荷兰蜂蜜蛋糕、曲奇、饼干、姜面包、姜饼和薄脆饼干，以及任何基于马铃薯的产品，例如，薯条、pommes frites、薯片、炸薯片、炸丸子、制作的土豆点心，或基于玉米的产品，例如玉米片或玉米粉网饼。
上文提到的原材料已知含有相当含量的天冬酰胺，其在生产工艺的加热步骤期间参与丙烯酰胺的形成。或者，天冬酰胺可来自并非所述原材料的其它来源，例如，来自蛋白水解产物，例如酵母提取物，大豆水解产物，酪蛋白水解产物等(在食物生产工艺中用作为添加剂)。一种优选的生产工艺是面包和来自小麦面粉和/或其它谷物来源的面粉的其它烘焙产品的烘焙。另一优选的生产工艺是从马铃薯切片油炸薯片。
优选的加热步骤是这样的，其中，中间产物食物产品的至少一部分，例如，食物产品的表面，暴露给促进丙烯酰胺形成的温度，例如，110°c或更高，120°c或更高的温度。根据本发明的工艺中的加热步骤可在烤箱中进行，例如，在180-220°C间的温度下进行，例如，用于烘焙面包和其它烘焙产品，或者在油中进行，例如炸薯片，例如在160-190°C下进行。
根据本发明的蛋白的另一应用是其用在动物和人的肿瘤治疗中。肿瘤细胞的代谢需要L-天冬酰胺，其可被天冬酰胺酶快速降解。根据本发明的蛋白还可用作为佐剂用于治疗一些人白血病。在实验动物和人中施用天冬酰胺酶使得某些淋巴瘤和白血病消退。因此， 在一种实施方式中，本发明涉及根据本发明的蛋白用作为药物的用途，例如，用于动物和人的肿瘤治疗中，例如，用于对淋巴瘤或白血病的治疗中。
在所有上述应用中，蛋白可以蛋白本身使用或其可用在组合物中。因此，在另一方面中，本发明涉及包含根据本发明的蛋白或核苷酸序列的组合物。根据本发明的组合物可包含其他成分，比如其他酶，比如脂肪分解酶(比如磷脂酶、半乳糖脂酶、三酰基甘油酯酶)、酯酶、纤维素酶、半纤维素酶(比如木聚糖酶)、淀粉酶(比如0-淀粉酶、0-淀粉酶、 生麦芽糖淀粉酶)、蛋白酶；核苷酸、赋形剂、填充剂或佐剂。
实施例I
根据本发明的天冬酰胺酶的生产和纯化
按照W02004/030468所述，通过构建含有如SEQ ID No. 17中描绘的DNA序列的表达质粒，用该质粒转化Aspergillus niger菌株并培养Aspergillus niger菌株,来获得具有如在SEQ ID NO. 8中描绘的氨基酸序列的本发明的天冬酰胺酶S7。
培养含有正确表达质粒的Aspergillus niger之后,通过在4°C以5000 X g对发酵液离心30分钟，来制备不含细胞的上清液。再将上清液进一步分别滤过Miracloth过滤器(Calbiochem cat#475855)和 GF/AWhatmann Glass 微纤维过滤器(15Omm0),以除去任何固体。为除去任何真菌材料，可用4N KOH将上清液调节至pH为5，并在抽吸(suction) 下，经2 μ m(瓶-顶)过滤器过滤灭菌。将上清液贮藏于4°C或冷冻于_20°C，直到使用。
通过阴离子离子交换色谱，从不含细胞的上清液开始对天冬酰胺酶加以纯化，并经由F1D-IO柱(Amers·ham Biosciences)对天冬酰胺酶进行ccUF脱盐。将经脱盐的材料应用到在20mM组氨酸缓冲液(pH 5.96)中平衡过的Mono-Q或Q-Sepharose柱上。充分洗漆之后，使用O至IMNaCl的梯度，从柱上洗脱天冬酰胺酶。
可分别使用如在SEQ ID No. IUSEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 15,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18 和 SEQ IDNo. 19 中描绘的 DNA 序列，以相同的方式产生并分离具有如在 SEQ IDNo. 2,SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6, SEQID No. 7,SEQ ID No. 9和SEQ ID NO. 10中描绘的氨基酸序列的根据本发明的其他变体 SI、S2、S3、S4、S5、S6、S8 和 S9。
实施例2
作为DH函数的比活件
使用不含细胞的上清液，在37°C下，50mM磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中，于pH = 4、 pH = 5、pH = 6、pH = 7、pH = 8时测定天冬酰胺酶变体的比活性。通过用样品的活性(以单位/ml)除在样品中存在的mg蛋白/ml天冬酰胺酶，来测量比活性。
使用L-天冬酰胺作为底物来测量天冬酰胺酶活性。根据Berthelot反应来测量通过酶作用释放的氨的量。从Sigma获得现成可用的试剂苯酹硝普(phenolnitroprusside) 和碱性漂白粉(alkaline hypoclorite)。在50mM朽1檬酸和50mM焦磷酸钠的具有想要的 pH的缓冲液的混合物中，将100 μ I酶样品与2000 μ IlOOmM L-天冬酰胺混合。在37°C孵育30分钟之后，通过加入400 μ I 25%三氯乙酸来终止反应，之后加入2500 μ I水。孵育期间，除非另有说明，温度固定为37°C。
本领域技术人员将理解，应按以下要求来选择酶的剂量使得在上述条件下孵育之后获得显著高于背景的信号但获得的信号仍在与加入的酶的量成比例的范围内。优选地，反应是零级的。
终止反应后，将4μ I孵育混合物加入156 μ I水中。随后，加入34 μ I苯酚/硝普溶液(Sigma P6994)和34 μ I碱性漂白粉溶液(Sigma A1727)。37°C孵育676秒后，在 600nm下测量消光度。通过包括恰当的空白，来针对背景信号校正读数。用具有(TCA)失活的酶的样品作为空白。检验在自动分析仪，例如Konelab Arena 30 (Thermo Scientific) 上进行。使用通过用600nm处测量的吸光度对标准系列的已知硫酸铵浓度作图制造的校正线，来测定活性。活性以单位表示，其中，一个单位被定义为在定义的检验条件下每分钟从 L-天冬酰胺释放I微摩尔氨所需的酶的量。
使用NuPAGF, Novex 4-12% Bis-Tris 12 孔凝胶(Invitrogen，NP0322B0X)， 通过PAA-SDS凝胶电泳，测定在不含细胞的上清液中的天冬酰胺酶蛋白的量。用 I μ lOXNuPAGB 样品还原试剂(Invitrogen，ΝΡ0004)、2· 5 μ 14XNuPAGE LDS 样品缓冲液(Invitrogen, NP0007)和5. 5 μ ImilliQ水在70°C下对I μ I的培养物上清液孵育 10分钟。将产生的还原样品在凝胶上进样。SeeBlue Plus2预染的标准物(Invitrogen, LC5925)用作尺寸标记物。另外，进样0.5μ的BSA(Sigma A9418)，作为蛋白量的校准物。 将凝胶在含有NuPAGE 抗氧化剂(Invitrogen，NP0005)的NuPAGE MES SDS运行缓冲液(Invitrogen，NP0002)中在200V下运行35分钟。电泳后，将凝胶在Fix溶液(7% HAc (v/v)和10%乙醇(v/v))中固定2 X 30分钟,用SYPRO Ruby蛋白凝胶染料(Invitrogen S12000)染色过夜并在Fix溶液中脱染2X30分钟。随后，用脱矿物质水洗涤凝胶并用 Typhoon 9200 扫描仪(GE Healthcare)扫描。使用 Image Quant TLv2003. 02 软件计算峰体积并基于BSA蛋白带计算蛋白浓度。
在不同的pH值下，较之ASN02(W02008/128974)(本中请中的SEQID NO. 20)和 Aspergillus niger野生型天冬酰胺酶(本中请中的SEQ ID NO. I),根据本发明的天冬酰胺酶的比活性的改进倍数在表I中示出。
表I
I突变体IpH 4 IpH 5~IpH 6~IpH 7~IpH 8WT65% 57%~35%~20%~9%ASN02~D63G+D111G+R122H100% 100% 100% 100% 100%51S16A+D63G+G132S+A293V74% 138% 123% 154% 97%52T41I+D63G+S88V+D111G+R122H 162% 167% 182% 198% 319%
权利要求
1.多肽，其具有根据SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ IDNO. 9 或 SEQ ID No. 10 的氨基酸序列或覆盖氨基酸 16-378、17-378、18-378、19-378、20-378、21-378、22-378、23-378、24-378、25-378 或 26-378的所述序列的一部分并展示天冬酰胺酶活性。
2.根据权利要求I的多肽，其展示了天冬酰胺酶活性并显示了下述比活性(i)在 37° C下在pH 5和pH 8之间的pH下，是SEQ ID NO: I的A. niger野生型天冬酰胺酶的比活性的至少两倍，和(ii)其在37° C下在pH 5、pH 6和pH 7下比在该温度和这些pH值下的来自WO 2008/128974的变体天冬酰胺酶ASN02的比活性至少高10%，其中所述多肽具有在SEQ IDN0. I的位置63上的天冬氨酸、甘氨酸或组氨酸和在位置88上的丝氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸。
3.编码根据权利要求I或2的多肽的核苷酸序列。
4.包含根据权利要求3的核苷酸序列的核苷酸构建体。
5.根据权利要求4的核苷酸构建体，其中所述构建体是载体。
6.用根据权利要求4或5的核苷酸构建体转化的细胞。
7.根据权利要求6的细胞，其中所述细胞是微生物，优选地是真菌或细菌。
8.根据权利要求I或2的多肽在食品工业中的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中所述多肽用来防止或减少丙烯酰胺在食物产品中形成。
10.包含根据权利要求I或2的多肽或根据权利要求3的核苷酸序列的组合物。
11.根据权利要求10的组合物，其还包含其他酶。
全文摘要
本发明涉及下述蛋白，所述蛋白展示天冬酰胺酶活性并具有根据SEQID NO.2–SEQ ID NO.10的氨基酸序列。本发明的蛋白的优点是，其在酸性、中性和碱性下展示的天冬酰胺酶活性(EC 3.5.1.1)的比活性比野生型天冬酰胺酶的比活性高许多倍。
文档编号C07K14/38GK102869772SQ201180021610
公开日2013年1月9日 申请日期2011年4月22日 优先权日2010年4月27日
发明者简·米特斯卡·拉恩·范德, 艾瑟·兰格·德, 马克·克里斯蒂安·斯托 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司