使用锁核酸进行精细胞和胚胎的性别特异性鉴定的制作方法
【专利摘要】本申请公开了包含与性别特异性重复序列结合的经标记锁核酸的精细胞和胚胎。用于鉴定包含经标记锁核酸的精细胞或胚胎和将其与不包含经标记寡核苷酸的精细胞或胚胎分离的方法产生了性别富集的精细胞或胚胎级分。分离出的级分用于产生预定性别的后代。
【专利说明】使用锁核酸进行精细胞和胚胎的性别特异性鉴定
[0001] 绪论
[0002] 在许多行业（包括畜牧业）中，期望产生预定性别或者预定性别比率的后代。精 细胞或者胚胎的性别特异性分离可促进产生具有预定性别的后代。分离出的精细胞可用于 人工授精或体外受精以产生发育成预定性别的生物体的合子。然而，缺乏产生性别足够富 集的精细胞或胚胎的群体的技术。
[0003] 概述
[0004] 在一方面，提供了用于通过使群体与经标记锁核酸接触来分离精细胞或胚胎的群 体的方法，所述经标记锁核酸能够与在所述群体的一部分中存在的性别特异性串联重复序 列结合。然后将所述经标记精细胞或胚胎与所述未经标记精细胞分离。
[0005] 在一方面，提供了具有性别特异性串联重复序列和与所述性别特异性序列结合的 经标记寡核苷酸部分（例如锁核酸）的精细胞或胚胎。
[0006] 在另一方面，提供了具有存在于X或Y染色体上的性别特异性串联重复序列的精 细胞或胚胎的群体。所述精细胞或胚胎的群体的一部分具有与所述性别特异性序列结合的 经标记寡核苷酸部分，其是锁核酸。
[0007] 在一方面，通过使胚胎的至少一个细胞与锁核酸接触来鉴定胚胎的性别。所述锁 核酸包含标记并且能够与存在于雌性胚胎或雄性胚胎细胞中的性别特异性串联重复序列 结合。检测标记在胚胎中的存在与否有利于鉴定胚胎的性别。
[0008] 在一方面，提供了用于由锁核酸来靶向序列特异性DNA的方法，例如用于活细胞 中基因表达的位点特异性调节，或者位点特异性基因组DNA改变（包括突变、重组或修复） 的诱导。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1是示出染色体上的性别特异性串联重复序列（GSTRS)和靶序列的位置的示意 图。
[0010] 图2是示出串联重复序列（GSTRS)的位置的牛Y染色体之重复的非表达序列。
[0011] 图3是示出合适的芘官能化锁核酸的结构和具有双链核苷酸的侵入性锁核酸的 功能的图。T MP是实验温度而是解离温度。
[0012] 图4是示出雄性牛体细胞核和侵入性LNA的照片。
[0013] 图5是示出固定的雄性牛胚胎上的侵入性LNA_Cy3的照片。
[0014] 图6是示出经INV-Cy3探针标记并且经H〇echst33342共标记的活牛胚胎从而示 出经Hoechst标记的细胞核中INV_Cy3的共定位的照片。
[0015] 图7是示出杂合到对y-染色体序列具有特异性的iLNA探针的固定的公猪精子之 照片。
[0016] 详述
[0017] 本发明涉及鉴定精细胞和胚胎的性别以及产生X或Y染色体富集的精细胞级分 (fraction)或胚胎级分。在一个实施方案中，本发明提供了用于分离包含与到性别特异性 串联重复序列或性别特异性串联重复序列互补序列（complement)结合的经标记寡核苷酸 部分（moiety)(锁核酸）之精细胞的方法。寡核苷酸部分以足够的数量合适地结合到染色 体区域以产生可检测信号，所述可检测信号可用作将包含性别特异性串联重复序列的细胞 与不包含性别特异性串联重复序列的细胞区分和任选地分离的基础。本发明还提供了用于 将携带X染色体的精细胞或胚胎与携带Y染色体的精细胞或胚胎分离的方法。性别富集的 精细胞级分可用于使卵子受精以产生预定性别的后代。本发明还提供了用来选择携带X染 色体的胚胎或携带Y染色体的胚胎的方法。在合适情况下，已经与经标记锁核酸接触的胚 胎是有活力的，从而避免破坏胚胎的一个或更多个细胞。
[0018] 在另一方面，本发明涉及通过特异性结合和活化锁核酸来靶向序列特异性DNA的 能力，其可用于活细胞中基因表达的位点特异性调节、特异性基因组DNA改变（包括突变、 重组或修复）的诱导。
[0019] 如本文所使用的，"性别特异性串联重复序列"或"GSTRS"是在Y染色体或X染色 体上但并不同时在两者上重复的非常染色体的染色体序列。多个GSTRS存在于X或Y染色 体区域，如图1中示意性地示出的。图2示出了示出串联重复序列（GSTRS)位置的牛Y染色 体之重复的非表达序列。GSTRS可存在于X或Y染色体上的任意位置。在一些实施方案中， 本发明的GSTRS靶标存在于染色体末端或染色体末端附近。性别特异性串联重复序列可包 含至少约10个核苷酸，至少约50个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约500个核苷酸，至 少约1，000个核苷酸，至少约2, 000个核苷酸，至少约3, 000个核苷酸，或者至少约4, 000个 核苷酸，并且少于约10, 〇〇〇个核苷酸，少于约9, 000个核苷酸，少于约8, 000个核苷酸，少 于约7, 000个核苷酸，少于约6, 000个核苷酸，或者少于约5, 000个核苷酸。合适地，在重 复的GSTRS的每个单元之间具有少于约50, 000个核苷酸，约10, 000个核苷酸，约5, 000个 核苷酸，约3, 000个核苷酸，约2, 000个核苷酸，约1，000个核苷酸，约500个核苷酸，约300 个核苷酸，约100个核苷酸，约10个核苷酸，约1个核苷酸，或者零个核苷酸。GSTRS不必 以完全相同的序列被重复，并且重复序列的一些变型是可能的而不影响本发明的范围。重 复的GSTRS的单元彼此可共有至少约70 %、至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约 95%、至少约97%、至少约98%或者至少约99%的同一性（identity)。可使用在BLASTn 或MEGABLAST程序中使用的算法来测定同一性百分比，其可用于获得与参考多核苷酸同源 的序列，如本领域已知的。Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250描述了用于序列比对的算法。GSTRS可在染色体上重复至少约50次，至 少约100次，至少约200次，至少约300次，至少约400次，至少约500次，至少约750次，或 者至少约1000次。
[0020] 对于每个GSTRS，锁核酸可被选择为与GSTRS或GSTRS的互补序列结合。如图1 中示意性地描绘的，锁核酸可靶向GSTRS中较短的靶序列。如本文所使用的，"靶序列"是 GSTRS中的DNA区段，其中锁核酸与靶序列或靶序列的互补序列结合。靶序列可包含至少约 4个、至少约6个、至少约8个、至少约10个、至少约12个、至少约14个核苷酸，至少约16 个核苷酸，或者至少约18个核苷酸。靶序列可包含少于约100个、少于约90个、少于约80 个、少于约70个、少于约50个、少于约40个、少于约30个、少于约20个、或者少于约16个 核苷酸。锁核酸可结合到GSTRS或GSTRS互补序列的至少约4个核苷酸，至少约5个核苷 酸,至少约6个核苷酸，至少约9个核苷酸，至少约12个核苷酸，至少约15个核苷酸，至少 约20个核苷酸，至少约25个核苷酸，至少约30个核苷酸，或者至少约35个核苷酸上。锁 核酸可结合到GSTRS或GSTRS互补序列的少于约100个核苷酸，少于约50个核苷酸，少于 约45个核苷酸，少于约40个核苷酸，或者少于约20个核苷酸上。
[0021] 可通过在公共数据库中搜索仅在X或Y染色体上高度重复的DNA序列来选择合适 的GSTRS。可通过扫描GSTRS的连续嘌呤或连续嘧啶（例如同型嘌呤或同型嘧啶序列）来 选择GSTRS中合适的靶序列。同型嘌呤或同型嘧啶序列有利于使寡核苷酸部分（例如锁核 酸）结合到双螺旋DNA的大沟（major groove)以形成三链体。性别特异性串联重复序列 中的靶序列可包括但不限于同型嘌呤或同型嘧啶序列，如在某些实施方案中那样，锁核酸 能够结合任意序列的DNA，包括混合的DNA序列，所述混合的DNA序列包括所有不同的核苷 酸，并且不仅是同型嘌呤或同型嘧啶。
[0022] 在一些实施方案中，靶序列是GSTRS中的自身重复单元。GSTRS可包括靶序列的 至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约7个、至少约10个、 至少约15个、至少约50个、至少约100个、或者至少约200个重复单元。具有更高数量重 复单元的GSTRS可促进更多的寡核苷酸部分结合到GSTRS上。合适地，至少约5个、至少约 10个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约 1，000个、至少约5, 000个、至少约25, 000个、或者至少约50, 000个寡核苷酸部分结合到 GSTRS 上。
[0023] 在一些实施方案中，可在GSTRS或GSTRS互补序列中选择多于一个靶序列。具有更 高数量靶序列的GSTRS将促进更多寡核苷酸部分结合到GSTRS上。在另一些实施方案中， 可选择多于一种类型的锁核酸来结合GSTRS或GSTRS互补序列。
[0024] 与靶序列结合的寡核苷酸部分是锁核酸（LNA)，并且特别合适的是侵入性锁核酸 (iLNA)。锁核酸（LNA)是由"锁定"3'-内（北）构象中核糖之另外的桥修饰的经修饰RNA 核苷酸。可将LNA核苷酸与DNA或RNA残基混合。这样的寡核苷酸部分通常为化学合成的。 锁定核糖构象增强了碱基堆积和骨架预先组织。这显著地改进了寡核苷酸的杂交性质（溶 解温度）。
[0025] 侵入性LNA是具有嵌入剂官能化的2'-氨基-a -1-LNA单体的"+1链间拉链排列" 的DNA双螺旋。在生理学相关条件下，侵入性LNA有利于序列无限制地靶向双链DNA (dsDNA) 并且能够特异性地识别短的混合序列dsDNA靶标。
[0026] 目前的探针技术（例如TF0 (三链形成寡核苷酸）和PNA(肽核酸））通常经历靶 序列限制和/或需要非生理离子强度以有效识别dsDNA。侵入性LNA能够高效靶向异序列 的dsDNA，所述侵入性LNA为具有由N2-芘官能化2'-氨基-a -L-LNA单体的+1链间拉链 组成的能量热点（energetic hotpot)的双螺旋探针。iLNA核苷酸增加了基于寡核苷酸的 技术的强度、灵敏度和特异性并且在生理条件下有利于序列特异性靶向混合序列的dsDNA。
[0027] LNA和iLNA可化学地合成。在PCT公开No. W02011/032034中描述了用于合成LNA 和iLNA的合适方法，其通过引用整体并入本文。图3说明了合适的侵入性LNA的结构和功 能。锁核酸可示出对于双链DNA (通过Hoogsteen碱基配对）、单链DNA (通过Watson-Crick 碱基配对）和单链RNA祀标（通过Watson-Crick碱基配对）的增加的结合亲和力。锁核酸 改进了错配核酸靶标的辨别以最小化诊断和生物学应用中的假阳性和非靶向特异性效应。 锁核酸还可增强对酶（例如核酸酶）降解的稳定性。
[0028]
[0029] 式X中示出了适用于本文公开的方法和组合物中的锁核酸的C5官能化核苷酸。 对于式X，!? 1可选自氢、羟基、巯基、脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、带电部分以及金属络合 物。R2可选自氢、脂肪族、杂脂肪族、芳基、杂芳基、官能团保护基团、含杂原子的化合物（例 如含磷化合物、含氮化合物、含氧化合物、含硫化合物和含硒化合物）。R 3可选自氢、含杂原 子的化合物（例如含磷化合物、含氮化合物、含氧化合物、含硫化合物和含硒化合物）。R4是 选自天然或非天然核碱基的核碱基。连接子部分可选自脂肪族、芳基、杂脂肪族和杂芳基。 Y可选自氧、硫、或者NR5,其中R5选自氢、脂肪族、芳基、杂脂肪族和杂芳基；并且m+n = 2至 4。
[0030] 在某些实施方案中，R1可选自醚、羰基、腈基、二硫化物、硫醚、胺、氨基酸、氨基 糖苷、碳水化合物、荧光团、核苷、核苷酸、寡核苷酸、肽、嵌入剂、类脂质（lipidoids)、甾 醇、吓啉、蛋白质和维生素。在一些特定实施方案中，R 1可选自酰胺、酯、羧酸、醛、酮、精 胺衍生物、胍基团、自旋标记物、电化学探针、脂肪酸、甘油、乙二醇、聚乙二醇、氧化还原 活性的FRET标记和二茂铁衍生物。甚至更通常地，R 1可选自氢、羟基、巯基、伯胺、生物 素、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、突光素、罗丹明、花青、花、花、六苯并苯、金刚硼、η 丫陡、菲咯啉 (phenantroline)、二苯基憐醜基叠氮化物（diphenylphosphorylazide)、HIV Tat 片段、 transportan、胆固醇、石胆酸（lithocolic)-油基、肉豆蘧酰基、二十二烧基、月桂酰基、硬 脂酰基、棕榈酰基、油酰基以及亚油酰基、二氢睾酮、石胆酸、叶酸和维生素 E。
[0031] 在某些实施方案中，单体具有式Y
[0032]
【权利要求】
1. 用于分离精细胞或胚胎的群体的方法，其包括： a) 使所述群体与经标记锁核酸接触以提供经标记级分和未经标记级分，所述经标记锁 核酸能够与所述群体的一部分中的性别特异性串联重复序列结合；以及 b) 将所述经标记级分与所述未经标记级分分离。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述锁核酸包含侵入性锁核酸。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤（a)中，多种锁核酸结合到所述性别特 异性串联重复序列上。
4. 根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述锁核酸是经荧光标签、重密度标签、 磁性标签、纳米颗粒、毒素、DNA、siRNA、酶、特异性离子及其组合标记的。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述群体包含精细胞，并且所述经标记级分中至 少70%的细胞包含Y染色体，所述未经标记级分中至少70%的细胞包含X染色体。
6. 根据权利要求4所述的方法，其中所述群体包含精细胞，并且所述经标记级分中至 少70%的细胞包含X染色体，所述未经标记级分中至少70%的细胞包含Y染色体。
7. 根据权利要求1至4所述的方法，其中所述群体包含精细胞，并且其中在步骤（b)之 后所述经标记级分或所述未经标记级分中至少50%的细胞是有活力的。
8. 根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述群体包含精细胞，并且其中步骤 (b)中对细胞的分离包括通过流式细胞术、离心、磁力的物理分离或者使用影响代谢、活力、 运动性、完整性或受精能力的方法的化学分离。
9. 根据任一项前述权利要求所述的方法，其还包括在步骤（a)之前或在步骤（a)期间 透化所述精细胞或胚胎。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中使用电穿孔、脂质体、渗透压或渗透肽来透化所 述精细胞或胚胎。
11. 根据权利要求9所述的方法，其还包括在步骤（a)之前或在步骤（a)期间使用微颗 粒、纳米颗粒或其他颗粒来促进所述锁核酸穿透进入所述精细胞或胚胎。
12. 根据权利要求9所述的方法，其中所述锁核酸通过电穿孔、脂质体、纳米颗粒或微 颗粒、渗透压或者渗透肽来穿透经透化的精细胞或胚胎。
13. 根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述性别特异性串联重复序列包含端 粒序列。
14. 根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述性别特异性串联重复序列为约 2, 000个至约10, 000个核苷酸。
15. 根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述经标记寡核苷酸为约12个至约24 个核苷酸。
16. 根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述群体包含选自牛、猪、犬和马的哺 乳动物精细胞或哺乳动物胚胎。
17. 精细胞或胚胎，其包含性别特异性串联重复序列和与所述性别特异性串联重复序 列结合的锁核酸。
18. 根据权利要求17所述的精细胞或胚胎，其中所述锁核酸是侵入性锁核酸。
19. 根据权利要求17或18所述的精细胞或胚胎，其中所述锁核酸是经荧光标签、重密 度标签、磁性标签、纳米颗粒或其组合标记的。
20. 精细胞的群体，所述群体中的每个细胞包含含有性别特异性串联重复序列的X染 色体或者含有性别特异性串联重复序列的Y染色体，其中所述细胞中的至少30%包含与所 述性别特异性序列结合的锁核酸。
21. 根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞中的至少70 %包含与所述性别特异性 序列结合的所述锁核酸。
22. 根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞中的至少90 %包含与所述性别特异性 序列结合的所述锁核酸。
23. 用于鉴定胚胎性别的方法，所述方法包括： (a) 使所述胚胎的至少一个细胞与锁核酸接触，所述锁核酸包含标记并且能够结合性 别特异性串联重复序列，以及 (b) 检测所述胚胎中所述标记的存在与否。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述胚胎的至少一个细胞是有活力的。
25. 根据权利要求23或24所述的方法，其中使所述胚胎的每个细胞与所述锁核酸接 触。
26. 根据权利要求23、24或25所述的方法，其中所述胚胎包含与所述性别特异性串联 重复序列结合的所述锁核酸并且其中所述胚胎是有活力的。
27. 根据权利要求23、24、25或26所述的方法，其中所述标记包含CY3并且其中使用荧 光测定技术来检测所述标记。
【文档编号】A61B10/00GK104105450SQ201380004915
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年1月3日 优先权日:2012年1月6日
【发明者】布雷德利·迪迪翁, 约翰·韦斯泰根, 帕特里克·赫尔德利奇卡 申请人:Mofa集团有限责任公司