定每孔的0〇45。值（加终止液的反应板应在15分钟内读取0D4W值）。
[0034] 上述说明书中也可m己载如下内容：
[00巧]检测结果的判定；
[003引1、阴性对照00450平均值应该《0. 2,否则无效。
[0037] 2、阳性对照每个检测值应该在0. 6-1. 8之间，否则无效。
[003引 3、临界值的计算；临界值=0. 23X阳性对照0045。值平均值。
[003引样品0045。值<临界值，则初步检测为FMDV阴性；样品0D值贫临界值，则初步检测 为FMDV阳性，需重新检测。重检时每重检样品平行2次。重检后若两孔均为FMDV阴性，贝U 判断为FMDV阴性诺任一孔为阳性，则判断为FMDV阳性。
[0040] 上述试剂盒在制备检测是否感染动物口蹄疫病毒病的试剂盒中的应用也属于本 发明的保护范围；其中，动物口蹄疫病毒病为猪口蹄疫病毒病；具体为猪0型口蹄疫病毒引 起的猪口蹄疫病毒病；更具体为猪口蹄疫0R/80病毒引起的猪口蹄疫病毒病。
[0041] 本发明的积极效果在于；本发明采用生物信息学方法对结构蛋白的抗原表位进行 精确分析，从VP1蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合化ISA检测用的肤段。同时，采用先 进的固相合成肤技术合成多肤抗原用于包被酶标反应板W及制备试剂盒中的阳性对照血 清。由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肤，不含杂蛋白，纯度高，特异性强，灵敏度 高，因此可W有效地检测口蹄疫结构蛋白抗体，W判断被检动物是否感染口蹄疫病毒。实验 结果表明，试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。
[0042] 本检测试剂用猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白合成肤抗原包被聚苯己締微孔板，配W 辣根酶标记的兔抗猪IgG抗体和TMB底物液等试剂，应用间接法检测血清样本中猪口蹄疫 病毒VP1结构蛋白抗体，与猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒联用，可区分口蹄疫 病毒感染动物及疫苗免疫动物。
[0043] 采用人工合成结构蛋白VP1主要抗原位点的肤段作为包被抗原包被酶联反应板。 显著不同于现有的利用基因工程方法取得的结构蛋白包被抗原，不含其它杂蛋白，抗原纯 度高，特异性强，灵敏度高。可W有效地检测口蹄疫病毒感染后产生的结构蛋白VP1抗体， W判断被检动物是否感染口蹄疫病毒。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景 和良好的经济、社会效益。
[0044] 本试剂盒内含有用人工化学合成的多肤口蹄疫病毒结构蛋白VP1包被的聚苯己 締微孔板，羊抗猪IgG抗体辣根酶结合物，血清样品稀释液，浓缩洗漆液，阴性对照血清，阳 性对照血清，显色底物A，显色底物B，显色终止液，血清稀释板，和等组分。本试剂盒使用化 学合成VP1抗原肤包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可W高效地检测是否存在 口蹄疫病毒感染。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。
[0045] 本发明所设及的口蹄疫病毒结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂盒用于检测动 物是否感染口蹄疫病毒，有利于减少我国口蹄疫爆发所带来的损失，也有利于我国口蹄疫 防控体系的建立。
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0047] 实施例1、口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原的制备
[0048] 本试验针对国内口蹄疫流行毒株的不同，采用生物信息学方法对口蹄疫病毒0型 VP1结构蛋白多个亚型进行精确分析，筛选出合适的肤段，用全自动多肤合成仪分别合成出 根据流行毒株序列设计的2条肤，序列分别为序列表中序列1和序列中序列2所示，制成纯 度约90%的更新更全的包被抗原，能够适应口蹄疫病毒不断突变的特性，提高抗体阳性的 检出率。多肤合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的两个多肤，作为本 发明试剂盒的包被原。
[0049] 本发明的包被抗原可使用AppliedBiosystem全自动多肤合成仪（型号433A)制 备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc巧-fluoren5dmeth}doxyca;rbonyl，9-巧甲 氧幾基）修饰的氨基酸，使用化nkAmideMBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肤抗 原固相合成、多肤裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥W及保存五部分。W下分别进行说明：
[0050] -、包被抗原固相合成
[0051] 1、合成试剂的准备
[0052] 合成包被抗原氨基酸序列如SEQIDNO;1和SEQIDNO;2所示。
[0053] 依据包被抗原序列W及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸（购自NOVA公 司），加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子 梓紧，贴标签，记录所合成肤的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装 入合成仪。配制适量的合成试剂包括100%的NMP、3%的AIM(已酷咪挫）、35%的PIP(嗽 晚）、100%的MeOH(甲醇）等放置到相对应的试剂瓶中。
[0054] 2、合成仪状态的检测
[00巧]检查433A多肤合成仪器是否止常运行，开机后，运行RunSelfTest程序，仪 器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常（433A正常表压 10.化si)。合成前应对仪器的性能有所了解，所w要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送FlowRatel-18到合成仪，选择MainMenu-ModuleTest-按Prer或next找 ModuleA、ModuleD、Modulel、Modulel、ModuleA)-按Start-按more进行测量或观察，若 流量不合适，则调节下阀口压力，直至达到要求（具体检测要求见下表1)。
[0056] 表1.多肤合成仪流速检测标准表
[0057]
[005引 3、包被抗原合成开始
[0059] 在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送StdFmoc1.0SO1DIC90到合 成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肤的序列，保存。File-New-Run，检查Qiemistir是 否为StdFmoc1.0SolDie90;Sequence是否为所存名字；设定切cles;保存。最后发送 到合成仪上。
[0060] MainMenu-切cleMonitor-begin,开始运行。
[0061] 4、包被抗原合成进行
[006引Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的巧环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱 除去，反应时用嗽晚（PI巧进攻9-H，0消除形成二苯巧締，很容易被二级环胺进攻形成稳 定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出"-N&"基团W进行合成反应。然后加入活化的下 一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-哲基苯并S挫（1-hy化oxybenzotriazole，H0BT)至反应 器内。
[0063] 如上述的多肤序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断 地重复合成步骤（合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2)。期间观察记录试剂用 量及运行情况。
[0064] 表2.包被抗原合成循环步骤
[0065]
[0066] 5、包被抗原合成结束
[0067] 包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肤树脂（肤现在还连接在树脂上） 基本洗漆干净。然后从多肤合成仪上取下反应器，再用100%甲醇洗漆肤树脂3次后，在通 风榻内吹干，然后将多肤树醋全部转移至栋色的聚己締瓶内，放入-20°C冰箱内，封口膜密 封备用。
[0068] 二、包被抗原的裂解及鉴定
[0069] 1、多肤抗原的裂解
[0070] 经上述反应所得到的多肤是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定 的有机强酸的酸解把多肤与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保 护基。步骤如下：
[0071] 从冰箱内取出合成的多肤树醋（指肤还连接在树脂上），放入一只化的圆底烧瓶 内，在通风榻内向烧瓶中加入90mlS氣己酸（Trifluoroaceticacid，TFA)、10ml的S丙基 硅烷（TI巧和磁揽拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力揽拌器