>[0040]4) 4°C，12000g离屯、15min，混合物在此后分层，下层为有机相，上层为水相（RNA就 在水相中），用无RNA酶的枪头将上层水相转移到新的无RNA酶的1. 5mL离屯、管中，注意尽 量不要吸到中间层，W免其中的蛋白质或DNA对所提取RNA造成污染。
[0041] W加入0. 5血异丙醇，混匀后，室温静置lOmin，沉淀RNA。
[0042]6)4°C，12000g离屯、lOmin后，观察到的沉淀即为RNA,弃上清（尽量吸净），加入 lmL75%的己醇（用去RNA酶水配置，现用现配），轻轻震荡离屯、管悬浮沉淀，洗漆沉淀。
[0043] 7)4°C，7500g离屯、lOmin后，弃上清（尽量吸净），超净台中干燥沉淀5-lOmin。
[0044] 8)加入10-20化去RNA酶水（根据RNA量而定），轻弹离心使沉淀充分溶解。
[0045] 9)55-601：温育后，取1^1样品稀释至5^以其中2.5^1进行电泳检测，2.5^1 用超微量分光光度计检测；剩余的样品用于cDNA合成或者保存于-70°C冰箱。
[0046] 4. 3' -RACE cDNA模板的制备
[0047] 整个过程在无RNA酶污染的条件下进行，操作步骤按SMARTer? RACE cDNA Amplification试剂盒进行，具体如下；
[0048] 1)准备缓冲液体系：将2yL的5 X First-Strand缓冲液；1yL的DTT (20mM); 1 y L的dNTP Mix(lOmM)依次加入到一个无RNA酶的PCR管中，置于室温等待下步反应。
[0049] 2)另备一无RNA酶的PCR管，依次加入1-3. 75uL的总RM;1 uL的5'-CDS Primer A,补水至4. 75 uL。
[0化0] 3)72°C温育3min，后42°C温育2min(PCR仪控温），冷却后，14000g简单离屯、10s。
[0化1] 4)准备母液体系；将步骤1中准备好的4yL的缓冲液混合物中依次加入0. 25yL 的RNA酶抑制剂（40U/yL) ;1yL的SMARTScribe反转录酶（100U)。
[005引W将5. 25化母液体系加入到步骤3中的PCR管中，轻柔混匀，简单离屯、。
[0化3] 6)42°C温育 90min，后 70°C加热lOmin。
[0化4] 7)根据总RNA的量，用Tricine和邸TA配置的缓冲液稀释产物，-20°C冰箱保存。
[0055] 5.第一链cDNA的合成
[0化6] 整个反转录过程在无RNA酶污染的条件下进行，操作步骤按Reved Aid First Strand cDNA Synthesis试剂盒进行，具体如下；
[0057] 1)在无RNA酶的PCR管中依次加入；2ygRNA(根据超微量分光光度计定量的结 果计算应该加入RNA的体积数），面aseI1yL，1yL Ribolock RNA酶抑制剂，混有MgCls的10 X Reaction缓冲液1化with,用去RNA酶水将体系补足到10化；轻微震荡后离屯、； [005引 ^37°C温育30min后，向体系内加入1化50mM邸TA，震荡后离心然后65°C温育 lOmin；
[0059] 扣加入1yLoligo-dT，用去RNA酶水补至12yL;
[0060] 4)65°C温育5min后，立即置于冰上；
[0061] 5)依次加入下列试剂，使体系达到2yL ;4yL的SXReaction缓冲液；2yL的 dNTP Mix(lOmM) ;1 y L的Revei^t Aid反转录酶和1 y L的化bolock RNA酶抑制剂；简单混 匀离屯、；
[006引 6) 42°C温育比，然后再70°C温育5min ;
[0063] 7)合成后存于-20°C或者-70°C冰箱，使用前按情况稀释若干倍。
[0064] 6. DTRC基因的扩增、测序
[00化]分析绿盲睹转录组仅得到DTRC基因cDNA的序列片段，需要设计特异性引物通过RACE技术获得DTRC基因3末端的序列，从而拼接得到全长序列。首先根据已知序列片段 设计了两条3 ' -RACE特异引物DTRC-3RACE-F1及DTRC-3RACE-F2，通过巢氏PCR得到3 ' -末 端的序列。通过转绿组分析及3'-RACE扩增，成功得到DTRC基因的起始密码子与终止密码 子。进一步设计巢式引物来扩增DTRC基因的全长序列，首先根据5' -及3-'端非编码区 序列，设计外侧引物DTRC-R)与DTRC-R0进行第一轮PCR扩增，随后W第一轮PCR产物为模 板，W内侧引物DTRC-F与DTRC-R来进行第二轮全长扩增。
[0066] 上述试验中详细的引物序列如下；
[0067] DTRC-3RACE-F1；AAAGTGTATCCCAACAATGCCAAC
[0068] DTRC-3RACE-F2 ；ACGAGAGCACGAAAAATCCCATG
[0069] DTRC-FO ；GTCCAACAACAACTGAACATCG
[0070] DTRC-RO；CGTCCAACGTGTTAATCAAAGT
[007U DTRC-F ;ATGGAATCCAAACGACCTGGC
[0072] DTRC-R；TTACTCCCTTAATTTAATAGAG
[0073]上述试验中RACE反应体系为；ExTaq Buffer(Mg"Plus)2. 5 y LdNTP混合物2 y L F引物（10 y M) 1 y L，R引物（10 y M) 1 y L，cDNA模板1 y L，Ex^q 0. 125 y L，灭菌水补 足25yL体系；反应条件为；94°C预变性3min ;94°C变性3〇3,55-6〇1：退火3〇3,721：延伸 40s，35个循环；最后72°C延伸10min。扩增全长引物的PCR反应体系；10XLAPCR缓冲液 II (Mg2+Plus) 5 y L，dNTP混合物（2. 5mM) 8 y L，cDNA模板2 y L，F引物（10 y M) 2 y L，R引物 (102yM)2yL，LA化9〇. 5化，灭菌水补足50化体系；反应条件为；94°C预变性3min;94°C 变性30s，55-60°C退火30s，72°C延伸3min，35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0074] PCR产物用1 %琼脂糖凝胶溶解在1XTAE的缓冲液中进行检测。在长波紫外灯下 切下与目的DNA片段大小相符的凝胶，置于1. 5mL的离屯、管中，用全式金的琼脂糖凝胶回收 试剂盒进行回收（操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行）。回收的3'RACE片段连接到 PEASY-T3载体上，全长片段连接到Promega的pGEM-T载体上，用化ermo的T4连接酶连接 (操作按照说明书进行）。连接体系转化至全式金Transl-Tl感受态细胞（转化步骤按感 受态细胞附带的说明书进行），培养过夜后，挑取白色单克隆进行PCR验证，阳性克隆用含 有浓度为100yg/mL的氨节的液体LB培养基震荡培养过夜，保种后送测序。巧U序结果使用 DNAMAN软件进行拼接、比对，选择具有正确开放阅读框的克隆进行下一步的实验。
[0075] 克隆得到DTRC基因的全长为2736bp，编码的911个氨基酸，详细的核酸序列和氨 基酸序列如序列表中SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 1所示。
[0076] 实施例2 DTRC基因表达谱分析和氨基酸序列结构分析
[0077] 1. DTRC基因的表达谱分析
[007引根据DTRC基因的序列设计一对特异引物，WGADPH基因为内参，通过Real-time PCR分析DTRC基因在绿盲睹不同发育阶段及成虫不同组织中的表达谱，结果见图2。绿盲 睹不同发育阶段中，DTRC基因在1龄若虫中的相对表达量最高，随着龄期的增加，相对表达 量越来越低（图2A)。在绿盲睹成虫不同组织中，足中DTRC基因的表达量最高，其次是触角 和翅（图2B)。上述试验中详细的引物序列如下：
[0079] AlucGADPH-QF:CGAGTTCCTGTCCCTAATGTTTC
[0080]AlucGADPH-QR:GCCTCCTTCACCTTCTGCTT
[OOW] AlucDTRC-QF:GAAGGGAATGATGGCTCTTACA
[0082] AlucDTRC-QR:GTTCGGATCAACTCCCTCATC
[0083] 2. DTRC通道蛋白氨基酸序列结构分析
[0084] 序列测序正确后，使用在线软件工具SMART(http://smart, embl-heidelberg. de/)对DTRC氨基酸序列进行蛋白二级结构域及功能域预测，使用在线软件TMHMM (http:// WWW,cbs.化山dk/se:rvices/TMHMM-2. 0/)对DTRC氨基酸序列的跨膜结构域预测，如图1所 示。图中ANK代表错蛋白重复序列，TM代表跨膜结构域，预测结果结果表明DTRC通