一种金黄色葡萄球菌肠毒素a的核酸适配体s3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA) 核酸适配体S3及其应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌是引起医院感染及社会感染最常见的致病菌之一。它不仅可以引 起感染组织的化脓、坏死和脓肿形成，还可以通过分泌各种外毒素，包括金黄色葡萄球菌肠 毒素（SEs)、溶血素、毒素休克综合症毒素1等，导致食物中毒和毒素休克综合征等严重疾 病。在美国，由SEs引起的食物中毒占细菌性食物中毒的33% ;加拿大则更多，占45%，我 国每年发生的此类中毒也较多见，其中SEA是引起食物中毒最常见的毒素。作为一种超抗 原，SEA无需经抗原递呈细胞的加工，可直接刺激T淋巴细胞的活化与增殖，从而触发复杂 的炎症级联反应，大量产生并释放IFN-γ、TNF-a、IL-2、IL-6等细胞因子和炎症介质。此 外，SEA理化性质相对稳定，对化学灭活剂、蛋白酶和温度、pH改变均有一定的抵抗力。
[0003] 治疗SEA引起的食物中毒和毒素休克，临床常采用抗炎、补液等对症支持疗法。最 新研究发现，抑制SEA的超抗原活性，在初始阶段阻断炎症级联反应的发生，是治疗SEA相 关疾病的有效策略。基于此策略，研制各种多肽药物、抗体药物、疫苗等，已成为的SEA生物 技术新药研究的热点。
[0004] SEA的检测主要采用免疫学方法，包括沉淀反应、凝集反应、ELISA、固相RIA、生物 传感器等，这些方法使用抗体作为SEA检测的识别元件，而抗体的制备存在周期长，步骤繁 琐，成本高等不足之处。近年来，以检测SEA基因为目标的分子生物学方法发展较快，但PCR 等分子生物学方法仍存在假阳性、假阴性，基因沉没表达等技术难题。因此，研制具有更高 灵敏度、经济、简便的SEA检测新技术，对于食品卫生监督、临床金黄色葡萄球菌感染的诊 疗等都有重要意义。
[0005] 适配体又被称为"合成抗体"、"化学抗体"，其化学本质是一条单链寡核酸分 子（ssDNA或RNA)折叠成特定三维结构与祀物质高亲和力和高特异性结合。适配体 的获得通过指数富集配体的系统进化技术（Systematicevolutionofligandsby exponentialenrichment,SELEX)的体外筛选过程：首先，体外化学合成一个含有25~60nt 随机序列的单链寡核苷酸文库；用文库与祀物质混合，洗掉未与祀物质结合的核酸，收集与 靶物质结合的核酸分子；以此核酸分子为模板进行PCR扩增，分离单链寡核苷酸作为下一 轮筛选的次级文库。通过重复的筛选与扩增，与靶物质有高亲和力的单链寡核苷酸，即适配 体，从非常大的随机文库中被分离出来。
[0006] 由于单链寡核苷酸分子的三维构象灵活多变，很容易形成与靶物质结合的口袋结 构，因此理论上能与任何类型的靶物质结合。核酸适配体还有高亲和力、高特异性、可体外 合成、可通过修饰改变其功能及药代动力学特性、无免疫原性等优点。利用适配体的诸多 优点，将适配体作为靶物质的识别元件，已开发出各种高灵敏、简便、精准的检测新技术。 在新药创制领域，适配体已成为生物技术药物研究的新宠。2005年，抗VEGF适配体新药 "Macugen"被FDA批准上市治疗老年性黄斑变性。几十种适配体候选药物正进行临床实验 研究。因此，筛选SEA的特异性核酸适配体并建立基于适配体的SEA检验新技术以及开发 抗SEA感染新药具有重要的科研、临床和市场价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种无毒性、分子量小且渗透性好的金黄色葡萄球菌肠毒 素A的核酸适配体S3及其应用。
[0008] 本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0009] 一种金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体S3,其特征在于：该核酸适配体S3的 序列如下所示：
[0010]ataccagcttattcaattcccgcctctgagcattattaatgttataccttacggctggag60
[0011] atagtaagtgcaatct 76
[0012] 所述核酸适配体S3的二级结构为茎环结构，其分子结构如下：
[0013]
[0014] 所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体S3,其特征在于：对核酸适配体S3 的5'端或3'端进行FITC、氨基、生物素、地高辛等化学修饰。
[0015] 所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体S3,其特征在于：对核酸适配体S3 做截短或延长或部分碱基替换等结构改造所得到的产物进行FITC、氨基、生物素、地高辛等 化学修饰。
[0016] 所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体S3的应用，其特征在于：在分离富 集或分析检测金黄色葡萄球菌肠毒素A中的非疾病诊断和治疗方法应用。
[0017] 所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体S3的应用，其特征在于：在金黄色 葡萄球菌感染治疗中的应用。
[0018] 较之现有技术而言，本发明的优点在于：筛选获得的核酸适配体S3无毒性，分子 量小，渗透性好，易于合成与标记。通过SELEX方法筛选获得的核酸适配体S3能高亲和力、 高特异性地与金黄色葡萄球菌肠毒素A结合，结合Kd值为36. 57nM，对其他同源蛋白不具有 识别功能。并且，该适配体拮抗剂能有效抑制SEA介导的人外周血单个核细胞增殖，减少炎 性细胞因子IFN-γ、TNF-a、IL-2和IL-6的释放。该核酸适配体S3既可以用于分离富集 样品中的痕量金黄色葡萄球菌肠毒素，也可以通过标记功能基团手段转化为报告适配体用 于分析检测食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素A，也可以有效的抑制SEA的超抗原活性，这对 金黄色葡萄球菌感染的检测和治疗有着十分重要的意义。
【附图说明】
[0019] 图1为荧光结合率实验监测筛选过程中ssDNA初始文库和次级文库对SEA-beads 的结合率图。
[0020] 图2为荧光结合率实验分析候选核酸适配体的特异性图。
[0021] 图3为荧光结合率实验分析候选核酸适配体的饱和结合曲线图。
[0022] 图4为淋巴细胞增殖实验绘制候选核酸适配体对SEA介导的PBMCs增殖的抑制率 图。
[0023] 图5为核酸适配体S3对SEA介导的细胞因子分泌的抑制率图。
[0024]图6为核酸适配体S3二级结构的生物学信息学模拟图。
【具体实施方式】
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施 例对上述方案做进一步说明。但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质 的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0026] 实施例1:体外筛选与SEA特异结合的核酸适配体
[0027] (1)随机单链DNA(ssDNA)文库的设计和合成
[0028] 设计并合成两端固定区域为18个核苷酸、中间随机区域为40个核苷酸的随机 ssDNA文库如下：5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N40 -AGATAGTAAGTGCAATCT-3'，库容量在 440。 所用引物序列分别为：
[0029]P1 :5, -ATACCAGCTTATTCAATT-3'；
[0030]P2 :5' -AGATTGCACTTACTATCT-3'；
[0031]P3 :5' -FAM-ATACCAGCTTATTCAATT-3' ；
[0032]P4 :5' -tripleBiotin-AGATTGCACTTACTATCT-3'。
[0033] 以上核酸序列均委托生物技术公司合成并经HPLC纯化。
[0034] (2)核酸适配体的筛选
[0035] 1)以羧基磁珠作为靶分子SEA的载体，便于结合序列的分离操作。使用商品化的 EDC试剂盒，参照说明书将SEA耦联到羧基磁珠表面；通过BCA法蛋白浓度测定试剂盒分 别测定耦联前后，溶液中SEA浓度的变化，计算耦联磁珠SEA-beads的SEA载量。制备的 SEA-beads溶于PBS缓冲液，4°C保存。
[0036] 2)取 2nmol初始ssDNA文库溶于 500μ1 选择缓冲液（50mmol/LTris-HCl，pH 7· 4,100mmol/LNaCl,lmmol/LMgCl2, 5mmol/LKC1)，在 95°C下，热变性约 5min，冰浴lOmin 后，在室温中放置lOmin;
[0037] 3)将变性处理的ssDNA文库与SEA-beads(SEA载量为lOOng)和酵母tRNA(摩尔 量为ssDNA文库的5倍）混合并于37°C孵育lh;
[0038]4)磁性分离SEA-beads，用含0.2 %BSA的选择缓冲液洗去未结合、弱结合及非特 异性结合的ssDNA ;与SEA-beads结合的ssDNA，在100°C、5min条件下，用200μ1ddH20洗 脱；
[0039] 5)以得到的ssDNA作为模板，用引物P3和P4进行PCR扩增，PCR扩增条件：94°C 预变性5min后；94°C变性30S，55°C退火30S，72°C延伸30S，15-25个循环（根据扩增产物 情况调整），72°C延伸5min，
[0040] 6)两端分别标有生物素和荧光基团FAM的PCR产物，使用小片段纯化试剂盒纯 化；
[0041]7)纯化后的PCR产物用链霉亲和素磁珠吸附（37°C20m