in)，洗涤缓冲液（5mM Tris-HCl，pH7·5，1ΜNaCl，500uMEDTA)洗涤三次后，用 50μ1NaOH溶液（0· 1M)在 37°C30min使dsDNA解链；收集上清，采用乙醇沉淀获得FAM标记的ssDNA文库，并溶解于 选择缓冲液中，作为下一轮筛选的次级文库；
[0042] 8)筛选过程共进行11轮。从第二轮开始，次级文库的用量均为50pmol;从第三轮 开始，对文库进行反筛操作，即将变性处理的文库与羧基磁珠于37°C孵育20min，收集上清 液，作为下一轮筛选的次级文库。
[0043] 实施例2:荧光结合率实验监测ssDNA文库的富集情况
[0044] (1)使用实施例1中，每轮筛选获得的FAM标记ssDNA文库被用于荧光结合率实验 中；
[0045] (2)取200μ1含ssDNA文库溶于选择缓冲液，在95 °C下，热变性约5min，冰浴 lOmin后，在室温中放置lOmin;然后与SEA-beads(SEA载量为100ng)混合，在暗盒中37°C 孵育lh;
[0046] (3)收集上清（含未结合SEA的ssDNA);与SEA-beads结合的ssDNA，在100°C 5min 条件下，用200 μ 1选择缓冲液洗脱；
[0047] (4)利用荧光定量仪分别测定初始的、未结合SEA的、结合SEA的ssDNA文库的荧 光强度，计算荧光结合率=(初始荧光强度-洗脱液荧光强度）/初始荧光强度X100%，计 算值代表ssDNA文库与SEA-beads的结合率。
[0048](5)如图1所示，随着筛选轮次的增加，ssDNA文库与SEA-beads的结合率从5. 2% 提高至45. 8%，而第9轮以后，其结合率变化不大。这些结果提示，与SEA结合的ssDNA文 库得到富集并达到饱和。
[0049] 实施例3:适配体的克隆测序及生物学分析
[0050] (1)以富集的ssDNA文库为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增；
[0051] (2)取纯化后的PCR产物进行T-A克隆；
[0052] (3)挑取50个阳性克隆，进行核苷酸序列分析；
[0053] (4)使用ClustalXSoftware分析核酸序列的同源性，挑选最多的4种序列作为 候选适配体，所述的候选适配体分别为33、56、512、523;使用网络工具!^ 〇1(1根据自由能最 低原则模拟候选适配体的二级结构。
[0054] 实施例4:候选核酸适配体S3、S6、S12、S23的特异性分析
[0055] (1)体外化学合成FAM标记的候选适配体，并溶于选择缓冲液；
[0056](2)参照实施例1中步骤（2)，将SEB、BSA与羧基磁珠耦联，获得耦联磁珠 SEB-beads和BSA-beads;
[0057] (3)取200μ1候选适配体溶液分别与親联磁珠SEA-beads、SEB-beads、BSA_beads 混合，在暗盒中37°C孵育lh，设羧基磁珠为对照；
[0058] (4)用0· 1%PBST洗磁珠3遍，与磁珠结合的适配体，在100°C5min条件下，用 200μ1选择缓冲液洗脱；
[0059] (5)利用荧光定量仪分别测定初始溶液和洗脱液的荧光强度，计算荧光结合率= (初始荧光强度-洗脱荧光强度）/初始荧光强度X1〇〇 %，用计算值初步代表候选适配体 与革G分子的结合率；
[0060] (6)如图2所示，4种候选适配体与SEA的结合率均显著高于其与BSA、SEB以及对 照的结合率，4种候选适配体与SEA的结合具有较好的特异性；其中适配体S3和S12与SEA 的结合率较高，适配体S3和S12与SEA的亲和力更好。
[0061] 实施例5:候选核酸适配体S3、S6、S12、S23的亲和力分析
[0062] (1)取不同浓度的FAM标记核酸适配体溶液分别与SEA-beads混合，在暗盒中 37°C孵育lh;
[0063](2)参照实施例4中的步骤（4)和步骤（5)，实验获得并计算不同浓度核酸适配体 溶液与SEA-beads的荧光结合率；
[0064] (3)利用荧光结合率的计算值，绘制核酸适配体结合SEA的饱和结合曲线，通过非 线性回归分析计算适配体结合SEA的解离常数；
[0065] (4)如图3所示，我们获得了核酸适配体S3、S12的饱和结合曲线，经计算核酸适 配体S3、S12的解离常数分别为36. 57nM和75. 62nM，其中核酸适配体S3与SEA的亲和力 最佳。
[0066] 实施例6 :淋巴细胞增殖实验分析核酸适配体对SEA超抗原活性的抑制作用
[0067] (1)利用人外周血单个核细胞（PBMCs)进行淋巴细胞增殖实验，分析适配体对SEA 超抗原活性的抑制作用
[0068] (2)密度梯度离心法获得人PBMCs:稀释的健康人静脉血中加入等量淋巴细胞分 离液后经室温离心2011^11(2500印111/1^11)，离心后，吸取中间白膜层，？81?：8悬浮在含10%小 牛血清的RPMI1640培养液中。
[0069] (3)MTT法测定适配体对SEA介导PBMC增殖的作用：将人PBMCs悬液接（105个/ 孔）接种到96孔板，并加入SEA(25ng/ml)和候选适配体（16nM)，在37°C、5%C02的条件 下，培养48h;每孔中加入20μ1MTT溶液（5mg/ml，pH= 7. 4)，继续孵育4h。离心吸弃上 清，每孔加入100μ1SDS-DMF。酶标仪测定各孔吸光度值（570nm)，计算候选适配体对SEA 刺激人PBMCs增殖活性的抑制率。以上实验，每组设三个复孔。
[0070] (4)如图4所示，20倍摩尔浓度的适配体S3可有效抑制SEA介导的人PBMCs增殖 作用，抑制率为43%，S12的作用次之，抑制率约为13%，而S6和S23的抑制作用不明显， 表明适配体S3为最优候选适配体。
[0071] 实施例7:核酸适配体S3对SEA介导的细胞因子分泌的抑制作用
[0072](1)参照实施例6中的步骤（2)，分离人PBMCs;
[0073] (2)取将人PBMCs悬液接（105个/孔）接种到96孔板，并加入SEA(25ng/ml)和 不同浓度的适配体S3(0-16nM)，在37°C、5% 0)2的条件下，培养24h;
[0074](3)过滤收集培养上清，采用ELISA试剂盒检测培养上清中细胞因子IFN-γ、 TNF-α、IL-2、IL-6的浓度；以上实验，每组设三个复孔。
[0075] (4)如图5所示，适配体S3以剂量依赖方式抑制SEA刺激的细胞因子分泌，当S3 浓度为16nM时，人PBMCs分泌的细胞因子最低，IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6分别减少了 99%、97%、93%、79%〇
[0076] 本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同 替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种金黄色葡萄球菌肠毒素 A的核酸适配体S3,其特征在于：该核酸适配体S3的序 列如下所示： ataccagctt attcaattcc cgcctctgag cattattaat gttatacctt acggctggag 60 atagtaagtg caatct 76 〇2. 根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素 A的核酸适配体S3,其特征在于：所 述核酸适配体S3的二级结构为茎环结构，其分子结构如下：3. 根据权利要求1或2所述的金黄色葡萄球菌肠毒素 A的核酸适配体S3,其特征在于： 对核酸适配体S3的5'端或3'端进行FITC、氨基、生物素、地高辛等化学修饰。4. 根据权利要求1或2所述的金黄色葡萄球菌肠毒素 A的核酸适配体S3,其特征在于： 对核酸适配体S3做截短或延长或部分碱基替换等结构改造所得到的产物进行FITC、氨基、 生物素、地高辛等化学修饰。5. 根据权利要求1或2所述的金黄色葡萄球菌肠毒素 A的核酸适配体S3的应用，其 特征在于：在分离富集或分析检测金黄色葡萄球菌肠毒素 A中的非疾病诊断和治疗方法应 用。6. 根据权利要求1或2所述的金黄色葡萄球菌肠毒素 A的核酸适配体S3的应用，其特 征在于：在金黄色葡萄球菌感染治疗中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体S3及其应用。所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体S3具有独特的茎环结构，并可进行FITC、氨基、生物素、地高辛等化学修饰以及截短或延长或部分碱基替换等结构改造。所述金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体S3能高亲和力、高特异性地与金黄色葡萄球菌肠毒素A结合，并可在体外实验中抑制金黄色葡萄球菌肠毒素A的超抗原活性，无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。所述金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体S3可在分离富集或分析检测金黄色葡萄球菌肠毒素A中的非疾病诊断和治疗方法以及在金黄色葡萄球菌感染治疗中的应用。
【IPC分类】A61P31/04, A61K31/7088, C12N15/115, G01N33/68
【公开号】CN105349544
【申请号】CN201510825032
【发明人】王开宇, 兰小鹏, 陈庄, 杨湘越, 张鲜惠
【申请人】中国人民解放军南京军区福州总医院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月24日