9基因的开放阅读框长56化p，编码186个氨基酸残基，编码的蛋白命名为 化PYL9,其氨基酸序列为序列表中序列2。
[0089] 2、(ihPYL9基因基因组DNA的克隆
[0090] 提取陆地棉Y18叶片的基因组DNA为模板，用引物化PYL9F/R(表1)为引物进行 PCR扩增，得到949bp的PCR扩增产物（图1B)。
[0091] 经过测序，该PCR扩增产物具有序列表中序列3所示的核巧酸，其所示的化PYL9 基因基因组DNA。序列分析表明，化PYL9基因含有3个外显子，其转录区结构如图2所示。 内含子区均W碱基GU开始，W碱基AG结束，符合mRNA初级转录本的一般剪辑原则，运一结 果也与原来预测的结果是完全一致的。
[0092] 二、(ihPYL9的表达量分析
[0093] 1、化PYL9基因在棉花各组织的表达特性
[0094] 陆地棉（GossypiumhirsutumL)Y18不同组织样品采集：采集成熟期棉花的根、 茎、倒=叶，及收取的棉花种子，取样后液氮速冻，提取总RNA。
[009引将RNA反转录得到CDNA作为模板，用引物化PYL9qF/R(表1)为引物进行RT-PCR扩增，内参引物为化S3F/R。
[0096] 结果如图3和表2所示，可W看出，化PYL9基因在棉花的叶、根、茎及种子中均有 表达，其中在种子中的表达量最高，是叶片的2. 8倍。其次是在根中，为叶片中的1.67倍， 茎中的表达量则是叶片中的1. 24倍。总体来看，在各组织中的表达量较为均衡。化PYL9基 因在不同组织的表达量不同，可能与不同器官对ABA的响应差异密切相关。
[0097] 表2化PYL9基因在棉花各组织的相对表达量
[0099] 2、化PYL9在ABA诱导下的表达特性
[0100] 为了分析化PYL9基因是否受ABA的诱导，对生长20d的已经长出真叶的棉花Y18 幼苗进行ABA处理（用IOOuM的ABA水溶液喷洒20d棉花叶片的上下表面，全部喷湿，取处 理前、处理lh、3h、化的叶片液氮速冻）。
[0101] 提取ABA处理不同时间的幼苗叶片RNA，反转录得到CDNA为模板，用引物 (ihPYL9qF/R为引物进行RT-PCR扩增。内参引物为Hi S3F/R。
[0102] 结果如图4和表3所示，ABA处理1.化，化PYL9基因的表达量上升为处理前的2. 8 倍，处理化时，表达量上升至处理前的8倍，随着处理时间的进一步延长，化PYL9基因的表 达量开始下降，在处理6.化时，化PYL9基因的表达量下降到处理前的2. 2倍。运一结果说 明化PYL9基因在叶片中的表达受ABA的诱导。
[0103] 表3为化PYL9基因在ABA诱导条件下的表达情况
[0104]
[0105] 实施例2、化PYL9的抗旱性研究
[0106] 1、化PYL9过表达载体的构建
[0107] 本部分所用全部引物见表4和表5。
[010引 表4引物表
[0110] 注：表中单下划线所示为限制性酶切位点，双下划线所示为突变的碱基
[0111] 表5引物序列
[0114] 注：表中单下划线所示为限制性酶切位点，双下划线所示为突变的碱基
[0115] 提取陆地棉Y18叶片的RNA，反转录得到CDNA为模板，用化PYL9F1和化PYL9R1为 引物进行PCR扩增，得到574bp的PCR扩增产物（带酶切位点的化PYL9)。
[0116] 将带有NotI和XmaI酶切位点的(ihPYL9基因与TEASY?-BluntZero载体连 接后，与入口载体P8GWN巧en，etal.，2011)同时进行NotI和XmaI双酶切之后，回收 目的片段连接构建入 口载体p8GWN-GhPYL9。将祀arleygate3033(EarleyKW，HaagJ 民，Pontes0,etal.Gateway-compatiblevectorsforplantfunctionalgenomicsand proteomics[J].IliePlantJournal, 2006, 45(4) :616-629.)的Bar筛选标记替换为Kan 筛选标记构建成为目的载体pEarleyGate330。将入口载体p8GWN-她PYL9与目的载体 祀a;rleyGate330通过GatewayLRClonaseIIElnzymeMix进行LR反应，最终成功构建过表 达载体P化PYL9。LR反应体系如下：
[0117] 1)配制LR反应体系：
[011引。配制好后，轻轻混匀，25°C解育化；
[0120] (3)加入LOyLProteinaseK结束反应，轻轻混匀，37°C解育IOmin;
[0121] (4)转化大肠杆菌，涂含壮观霉素的LB固体培养基；
[0122] (5)挑起单菌落进行菌落PCR鉴定（引物为化PYL9F1/R1，得到574bp为阳性菌 落）。
[0123] 将阳性菌落提取质粒，经NotI和XmaI双酶切鉴定，结果如图5,1、P化PYL9经 NotI和XmaI双酶切鉴定；2 :p化PYL9质粒；得到12. 5肺的阳性质粒。
[0124] 将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中序列1所示的化PYL9基因与 祀arleyGate330发生LR重组反应，得到重组载体，命名为P化PYL9,也就是将序列8所示的 Kan筛选标记替换祀a;rleygate303中和PstI和ClaI位点间的DNA分子得到的载体。
[0125] 二、重组菌的构建
[0126] 将上述重组载体p(}hPYL9 转入农杆菌GV3101 狂hangX,HenriquesR,LinS,et al.Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthe floraldipmethod[J].化 1:ureProtocols, 2006, 1(2):641-646.)中，得到重组菌。
[0127]将重组菌进行菌落PCR扩增（引物为化PYL9F1/R1)，结果如图6所示，1-2 :两个 农杆菌单菌落分别经两对引物进行PCR鉴定；N:阴性对照；得到500bp的为阳性重组菌，命 名为GV3101/p(ihPYL9。
[0128] S、转(ihPYL9拟南芥的获得
[0129] 1、转化PYL9拟南芥的获得
[0130] 1)挑取农杆菌单菌落GV3101/P化PYL9,接种于5血Y邸抗性培养基中， 28°C250巧m培养2地；
[013U2) 1:100转接至500血Y邸抗性培养基中，28°C250巧m培养过夜至OD= 0.6-0. 8 ; [013引 3) 4, 000巧mIOmin离屯、农杆菌菌液，用250血配制好的悬浮液重悬；
[013引 4)将250血农杆菌悬浮液加入一个500血的烧杯中，再加入250血悬浮液（含 Selwet-L77100iiL)混匀，将处于花巷期、生长旺盛的拟南芥（W下也称为野生型拟南芥，CO^o,来源于ABRC，种子目录号为CS28166)(转化前一天诱透水倒置于烧杯中，计时侵染 30s，未侵染的花巷用枪头吸取悬浮液进行侵染；
[0134] 5)将侵染后的拟南芥遮光处理1化后置于正常培养条件下进行培养，得到T。代转 (ihPYL9拟南芥。
[0135] 2、转化PYL9拟南芥的PCR鉴定
[0136] 收取T。代转化PYL9拟南芥种子为TI代，将TI代种子在抗性MS平板化an: 50mg/ L)上进行筛选，播种并培养一周的拟南芥，抗性的拟南芥长出绿色的真叶、根生长正常，而 阴性的拟南芥在子叶期即发黄并不再生长。将抗性拟南芥幼苗移栽到营养±中继续生长， 得到Tl代转化PYL9拟南芥。
[0137] 待Tl代转化PYL9拟南芥长大后，取叶片提取微量DNA作为PCR模板，进行PCR鉴 定时，为保证鉴定的正确性，每个单株使用两对引物进行鉴定，第一对引物为化PYL9基因 的特异上下游引物化PYL9F1/R1，第二对引物为35S启动子上一段序列35SF作为上游引物， 基因特异引物(aiPYL9Rl作为下游引物，即35SF/(ihPYL9Rl(表5)。W野生型拟南芥（WT)为 对照。
[013引结果如图7所示，每组标号为1-28,分别为Tl代转化PYL9拟南芥单株，每组中左 边泳道为第一对引物扩增，右边泳道为第二对引物扩增，在检测的28个单株中，除13号未 获得扩增条带，检测为阴性外，其余27株转化PYL9拟南芥均检测为阳性，扩增出了与预期 大小相符的两个DNA条带574bp和77化P，表明获得了 27株阳性Tl代转化PYL9基因的拟 南芥植株。
[0139]鉴定为阳性Tl代转化PYL9拟南芥植株至成熟后收获每一单株的种子，为T 2代转 化PYL9拟南芥种子。Tz代转化PYL9拟南芥可W进行初步的生理功能分析，挑选具有代表 性的Tz代株系继代培养，每一株系播种至少20株T2代单株，待T2代植株成熟后继续收获 单株的种子，此时收获的种子为Ts代。将T3代每一个单株的种子播种在抗性筛选MS固体 培养基上化an:50mg/L)，播种约lOd，在抗性培养基上生长的即为纯合的Ts代转化PYL9拟 南芥植株。
[0140] 四、转化PYL9拟南芥的功能研究
[014。 1、化PYL9在逆境胁迫下使种子萌发滞后
[0142] Ts代转(ihPYL9 拟南芥 3 个不同的株系 0E(ihPYL9-16、0E(；hPYL9-21、0E(；hPYL9-22、 野生型拟南芥（WT)和pyl9突变体（SALK_032948)种子消毒后用0. 1%琼脂糖溶液悬浮， 用枪头吸取种子均匀打在不同处理组的培养基上，一种处理中，每一类别铺50粒种子，每 一种处理进行4组平行实验，即每一种处理中（如ABA处理），每一类别的种子共处理约 200粒。种子铺好后，用塑料薄膜封好，于4°C冰箱黑暗春化3d，然后转移至气候培养箱， 23°C/20°C，1化光照/她黑暗条件下培养。
[0143] 不同处理组的培养基如下：MS固体培养基、含0. 5yMABA的MS固体培养基（在 MS固体培养基中添加ABA，使其浓度为0. 5yM)、含IOOmM化Cl的MS培养基（在MS固体培 养基中添加化Cl,使其浓度为IOOmM)、含200mM甘露醇的MS固体培养基（在MS固体培养 基中添加甘露，使