[0323] 实施例7 :长雄野牛稻的PRR启动子及PRR基闵在玉米中的效果
[0324] 将实施例2中制备的Fr4片段（包含长雄野生稻的PRR7启动子及PRR7结构基 因）转化于玉米品种，以T1代进行产量相关性状的评价。
[0325] 将大小约1. 2mm的玉米未成熟胚（品种：A188)从温室栽培的植物中无菌取出并 浸渍于土壤杆菌悬浮用液体培养基（LS-inf、Ishidaetal.2007)。在46°C下热处理3分 钟后，在相同液体培养基中将未生成熟胚清洗1次。接着，进行15, 000rpm、4°C、10分钟的离 心处理。将离心处理后的未熟胚浸渍于LS-inf-AS培养基（Ishidaetal.2007)中，所述 培养基中以约1X109cfu/ml悬浮具有实施例2中制备的Fr4构建体的土壤杆菌LBA4404。 搅拌30秒，在室温下静置5分钟后，着床于共培培养基（LS-AS、Ishidaetal. 2007)，在 25°C、黑暗下培养7天。
[0326] 将进行了共培培养后的未成熟胚着床于含有潮霉素的选择培养基（LSD1. 5A及 1^01.58、18111(1&6丨&1.2007)，在251：、黑暗下进行培养。将增殖的愈伤组织切成小片，着 床于潮霉素再分化培养基（LSZ、Ishidaetal.2007)，在25°C、照明下培养2周。将再分化 的植物着床于生根培养基（LSF、Ishidaet&1.2007)，在25°0、照明下培养2周。将生根的 植物移植于温室内的罐中进行栽培。
[0327] 抽出的雄穗在开花前拔出进行去雄。将从未转化的玉米（品种：A188)中采集的 花粉与从雌穗中充分长出的须进行交配。收获包被枯萎的雌穗，在30°C下干燥2周后，将种 子脱粒。可以从44个个体中采种。
[0328] 从T0个体受精的穗中按照从大到小的顺序选择11个个体，以T1代进行产量相关 性状的评价。试验分成3次（第1次：5个系统、第2次：3个系统、第3次：3个系统的合计 11个系统）进行。在容量360ml的聚乙烯制罐中，1个系统各播种1粒（第1次试验为16 粒、合计16罐、第2次及第3次试验为25粒、合计25罐）。播种约2周后，切取叶的一部 分，浸渍于潮霉素溶液，调查潮霉素的抗性/敏感性。使潮霉素抵抗性和敏感性的个体为一 对并调整个体数量使其能够评价产量性状，移植于容量5100CC的聚乙烯制罐中继续栽培。 植被高度在播种14天后至56天后每周进行测定。将抽出的雄穗在开花前拔除进行去雄。 记录须从雌穗中抽出的日期，并且将从未转化玉米（品种：A188)中采集的花粉与从雌穗中 充分抽出的须进行杂交。收获穗后，测定雌穗长、每列粒数、穗重。对各系统进行潮霉素抗性 个体（基因持有个体）和潮霉素敏感性个体（基因缺失个体）的产量相关性状的比较。其 结果，可知在全部11个系统中的2个系统（Tl-No. 4、Tl-No. 6)中，抗性个体与敏感性个体 相比，雌穗长、每列粒数、穗重这3个性状变大（表9、图10)。并且，系统Tl-No. 4在接种第 35天以后，抗性个体与敏感性个体相比，植被高度变高，表明从营养生长期开始生长旺盛。
[0329] 如上所述，可知：与长雄野生稻的PRR7启动子可操作地连接的PRR7基因不仅使稻 的产量增大，还使玉米的产量增大。另外，表明营养生长期的生长液旺盛。
[0330][表9]
[0331] 效果得到确认的2系统的产量相关性状的数据
[0332]
[0333]实施例8 :源自长雄野牛稻的PRR基闵的cDNA构律体在玉米中的效果
[0334] 将实施例5中制备的源自长雄野生稻的PRR7基因的cDNA构建体（以下为Longi 构建体）转化至玉米品种，以T1代进行产量相关性状的评价。
[0335] 依据实施例7中记载的方法，将Longi构建体转化至玉米品种。得到的转化体移植 于温室内的罐中进行栽培。T0植物的雄穗在开花前拔除进行去雄，将从未转化的玉米（品 种：A188)中采集的花粉与从雌穗中充分抽出的须进行杂交。收获包被枯萎的雌穗，在30°C 下干燥2周后，将种子脱粒。从TO个体受精的穗中选择可充分确保着粒数的18穗，以T1代 进行产量相关性状的评价。试验分成3次（每次6个系统）进行。在容量360ml的聚乙烯 制罐中各接种1系统、25粒。作为对照，未转化的玉米（品种：A188)也同样地进行播种。播 种约2周后，切取叶的一部分，浸渍于潮霉素溶液，调查潮霉素的抗性、敏感性。使潮霉素抵 抗性和敏感性的个体为一对并调整个体数量，使其能够评价产量性状，移植于容量5100CC 的聚乙烯制罐中继续栽培。植被高度在接种14天后至56天后每周进行测定。抽出的雄穗 在开花前拔除进行去雄。记录从雌穗中的须抽出日，并且将从未转化玉米（品种：A188)中 采集的花粉与从雌穗中充分抽出的须进行杂交。收获穗并干燥后，测定雌穗长、每列粒数、 穗重。对各系统进行潮霉素抗性个体（基因持有个体）和潮霉素敏感性个体（基因缺失个 体）的产量相关性状的比较。对潮霉素敏感性个体（基因缺失个体）未分离的系统进行与 非重组的A188的比较。
[0336] 其结果，显示在全部18个系统中的2个系统（Tl-cDNANo. 11、Tl-cDNANo. 13) 中，抗性个体与敏感性个体或非重组A188相比，雌穗长、每列粒数、穗重这3个性状分别变 大（表10、图11)。在图11中，R为潮霉素抗性个体（基因持有个体），S为潮霉素敏感性 个体（基因缺失个体）。
[0337] 如上所述，可知：与长雄野生稻的PRR7启动子连接相同基因的cDNA而成的导入基 因使玉米的产量增大。即，确认到：在长雄野生稻的PRR7基因中，通过导入不含内含子的 cDNA，可得到本发明的效果。
[0338][表 10]
[0339] 效果得到确认的玉米转化体2个系统的产量相关性状的数据
[0340]
[0341]实施例9 :将源自长雄野牛稻的启动子分别与拟南芥PRR基闵编码厌域、高粱PRR 基闵编码厌域连接而成的构律体的效果
[0342]使用RT-PCR从拟南芥（Columbia)中分离PRR7基因（注册号：NM120359)的编码 区域，按照实施例5中记载的方法，通过与实施例5中制备的构建体的长雄野生稻PRR基因 编码区域进行取代，制备目标构建体。将分离的拟南芥PRR基因碱基序列示于序列号14， 将编码的氨基酸序列示于序列号15。接着，对于连接高粱PRR基因编码区域而成的构建 体，也通过同样的方法制备。进行NCBIblastn检索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast,cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSea rch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_L0C=blasthome)，将与长雄野生稻PRR7 基因编码区域 (序列号4)同一性高的基因（注册号：XM_002465391)作为PRR基因进行分离。使用RT-PCR 从高粱（品种：Golds〇rgho、KANEK0种苗）中分离该基因的编码区域序列，通过与实施 例5中制备的构建体的长雄野生稻PRR基因编码区域发生取代，得到目标构建体（序列号 18)。分离的源自高粱的PRR基因编码区域与通过NCBIblastn检索而命中的序列（注册 号：XM_002465391) 100%-致，2295碱基（序列号16)中，编码了 765氨基酸残基（序列号 17)。这些PRR基因翻译区域的氨基酸序列的相同性及同一性如图7所示。
[0343] 对于这些构建体，通过实施例5中记载的方法进行三亲交配及稻品种 "Yukihikari"的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对各构建体培育独立的60个个 体的转化体，采种T1种子。从各构建体中按照采种量从多到少的顺序选择18个个体，供于 T1的评价试验。
[0344]T1代对1个构建体测试18个系统（1个系统为12个个体）。播种在9月14日进 行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显示抗性的个体（基因持 有个体）作为移植的对象。在9月28日，在放入有稻用育苗土的容量570ml的聚乙烯制罐 中各移植1个个体（1个系统为12个罐、合计12个个体）。对施肥而言，在每个罐中，将N、 P、K设为各0? 21g、0. 33g、0. 05g。作为对照，栽培"Yukihikari"。栽培在日本Tobacco产 业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭体系温室（14小时30分钟 昼长的长昼条件）中进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗 粒数、种子育性、每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0345]将结果示于表11。首先，对拟南芥构建体观察全部18个系统的平均值，与对照 "Yukihikari"相比，杆长、每穗粒数、每穗重、基杆直径降低，认为没有产量增大效果。接着， 对于高粱构建体，与对照"Yukihikari"相比，发现杆长、穗长、每穗粒数大致相同，但每穗 中、基杆直径降低，未确认到产量增大效果。
[0346][表11]
[0347] 结合了长雄野生稻PRR启动子的cDNA构建体的产量相关性状的评价
[0348]
[0349]实施例10 :源自长雄野牛稻的PRR启动子和GUS基因的连接构建体
[0350] 制备源自长雄野生稻的PRR7启动子和⑶S基因的嵌合构建体，并调查有无转录。 如图12所示，制备在长雄野生稻的PRR7启动子区域的相邻下游连接GUS基因而成的构建 体。长雄野生稻PRR7基因的启动子区域具体而言分别连接转录起始点上游区域200个碱 基（序列号1的第34845-35044号碱基）、2000个碱基（序列号1的第33045-35044号碱 基），制备构建体P200、构建体P2000。制备不具有PRR7基因启动子区域的构建体P0也作 为对照用。
[0351] 使用制备的构建体进行栽培稻"Yukihikari"的转化。从植被高度生长至约10cm 的转基因稻的幼苗中对各构建体提取4个个体的根，并分别进行取样。通过实施例5中记 载的方法进行总RNA提取及cDNA合成。以得到的cDNA溶液作为模板，通过PCR法调查⑶S 基因是否被转录。引物对设计于GUS基因编码区域内所导入的内含子序列（190碱基）的 两外侧。即，若存在受到转录的剪接机制作用的成熟mRNA，则检测为450碱基的PCR扩增产 物。其结果，确认到在P200和P2000的转化体中存在转录活性（图13)。另外，在对照的 P0中，无法确认到源自成熟mRNA的PCR扩增产物。由上显示，P200和P2000在植物体内均 具有启动子活性。
[0352]实施例11:长雄野牛稻PRR基闵的表汰分析
[0353] 将于"Shiokari"中仅导入了长雄野生稻的第7染色体末端区域而成的系统 "No. 240"在人工气象室中在光周期14小时30分钟（26°C)、暗期9小时30分钟（20°C)的 长昼条件下栽培4周。从4个个体中对光周期开始后0小时（Oh)和6小时（6h)的最新的 完全展开叶分别进行取样。通过实施例5中记载的方法进行总RNA提取及cDNA合成。以 得到的cDNA溶液作为模板，通过非专利文献13(0gisoetal.)中记载的方法进行实时荧 光定量PCR(real-timePCR)。PRR7基因表达量以相对于同一样品的肌动蛋白基因表达量 的相对值表示。其结果，在光周期开始后〇小时（〇h)，PRR7基因表达量在0. 21-0. 32 (平均 0. 27)的范围，与此相对，光周期开始后6小时（6h)，可得到13. 69-18. 43 (平均16. 31)这 样的值（图14)。因此，显示长雄野生稻PRR7基因启动子不是组合型，而是光诱导表达。
[0354]实施例12 :将源自高粱的PRR启动子和高粱PRR基闵编码厌域连接而成的构律体 的效果
[0355] 通过PCR从高粱（品种：Goldsorgho、KANEK0种苗）中对实施例9中分离的高粱 PRR基因的启动子区域中的DNA片段进行扩增。使用得到的DNA片段中的序列号19所示的 序列取代实施例9中得到的构建体（序列号18)的1-9046所示的序列，由此得到目标构建 体（以下为"高粱构建体"）。
[0356] 对于该高粱构建体，依据实施例5中记载的方法进行三亲交配及稻品种 "Yukihikari"的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对得到的形状体（T0)培育60 个个体，采种T1种子。按照采种量从多到少的顺序选择18个个体，供于T1的评价试验。
[0357] 在T1代中，对18个系统（1个系统为12个个体）进行测试。接种在9月14日进 行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显示抗性的个体（基因持 有个体）作为移植的对象。在9月28日，在放入有稻用育苗土的容量570ml的聚乙烯制 罐中各移植1个个体（1个系统为12个罐、合计12个个体）。对施肥而言，在每个罐中，将 N(氮）、P(磷）、K(钾）各设为 0. 21g、0. 33g、0. 05g。作为对照，栽培"Yukihikari"。栽培 在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭体系温室 (14小时30分钟昼长的长昼条件）中进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对 象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0358] 将结果示于表12。对高粱构建体而言，全部18个系统中的2个系统（系统No. 8、 系统No. 10)与对照"Yukihikari"相比，杆长、每穗粒数、每穗重均超出。因此，在高粱构建 体中也发现产量提高效果。
[0359][表12]
[0360] 连接高粱PRR启动子和高粱PRRcDNA而成的构建体的产量相关性状的评价
[0361]
【主权项】
1. 一种核酸，其含有： (1) 序列号1的34845-35044所示的碱基序列、或 (2) 与序列号1的34845-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不促进 植物基因转录的活性的碱基序列。2. -种核酸，其含有： (1) 序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或 (2) 与序列号1的33045-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不促进 植物基因转录的活性的碱基序列。3. -种核酸，其含有： (1) 序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或 (2) 与序列号1的26779-35044所不的喊基序列具有至少80%的同一性，且显不促进 植物基因转录的活性的碱基序列。4. 一种核酸，其是源自长雄野生稻的碱基序列，其至少包含由序列号1的34845-35044 表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。5. 根据权利要求4所述的核酸，其含有由序列号1的33045-35044所示碱基序列构成 的核酸的片段。6. 根据权利要求4或5所述的核酸，其含有由序列号1的26779-35044所示碱基序列 构成的核酸的片段。7. -种核酸，其通过使下述核酸可操作地连接而成： (1) 权利要求1~6中任一项所述的核酸，以及 (2) 编码（a)~（c)规定的蛋白质的核酸，其中， (a) 与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一性的 氨基酸序列； (b) 含有植物的假应答调节因子蛋白质的假受体结构域的氨基酸序列或与其具有至少 90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质的CCT基序的氨基酸序列 或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且 (c) 具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCAl(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。8. 根据权利要求7所述的核酸，其能够增大植物的产量。9. 一种载体，其含有权利要求1~8中任一项所述的核酸。10. -种转基因植物，其含有权利要求7或8所述的核酸。11. 根据权利要求10所述的转基因植物，其中，所述植物为单子叶植物。12. 根据权利要求11所述的转基因植物，其中，所述植物为稻或玉米。13. -种制备产量增大的转基因植物的方法，其包括：将权利要求7或8所述的核酸或 权利要求9的载体导入植物的工序。14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物。15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述植物为稻或玉米。16. -种使植物的产量增大的方法，其包括：将权利要求7或8所述的核酸导入植物。17. -种用于对产量增加的植物进行筛选的DNA标记物，其含有序列号1的 26779-35044所示碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示碱基序列中的15~2000 个碱基。18. -种方法，其包括：对植物中权利要求17所述的DNA标记物进行检测，并在检测出 该DNA标记物时将该植物判断为高产性。19. 一种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所不碱基序列、或与序列号 1的34845-35044所不喊基序列具有至少90%的同一性的喊基序列的核酸来提尚植物基因 的转录活性。20. -种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或与序列 号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90 %的同一性的碱基序列的核酸来提高植物 基因的转录活性。21. -种使植物的产量增大的方法，其包括：将可操作地连接的下述（1)及（2)的核酸 导入植物，其中， (1) 包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸： (a) 序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或包含该碱基序列的一部分且显示促进 植物基因转录的活性的片段；或者 (b) 与上述（a)所示的碱基序列具有至少90%的同一性且显示促进植物基因转录的活 性的喊基序列； (2) 编码下述（c)~（e)规定的蛋白质的核酸： (c) 与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一性的 氨基酸序列； (d) 含有植物的假应答调节因子蛋白质的假受体结构域的氨基酸序列或与其具有至少 90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质的CCT基序的氨基酸序列 或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且 (e) 具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCAl(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。22. -种核酸，其编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质。23. 一种蛋白质，其具有序列号3所不氣基酸序列。24. -种核酸，其由下述（1)及（2)的核酸可操作地连接而成，其中， (1) 包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸： (a) 序列号19所示碱基序列；或 (b) 与序列号19所示的碱基序列具有至少80%的同一性且显示促进植物基因转录的 活性的碱基序列， (2) 编码由下述（c)~（e)规定的蛋白质的核酸： (c) 序列号17所示氨基酸序列、或与序列号Y所示氨基酸序列具有至少80%的同一性 的氨基酸序列； (d) 含有植物的假应答调节因子蛋白质的假受体结构域的氨基酸序列或与其具有至少 90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质的CCT基序的氨基酸序列 或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且 (e) 具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCAl(Circadian
【专利摘要】本发明提供一种可对植物赋予高产性的核酸。并且，本发明还提供一种使用这样的核酸使产量增大的转基因植物和使植物的产量增大的方法。可通过将下述构建体导入植物来对该植物赋予高产性，所述构件体通过使结构基因长雄野生稻的假应答调节因子的启动子、和/或植物的假应答调节因子可操作地连接而成。
【IPC分类】C12N15/09, A01H5/00, C12Q1/68, A01H1/00
【公开号】CN104903444
【申请号】CN201380057268
【发明人】柏原正和, 小森俊之, 小鞠敏彦, 前川雅彦
【申请人】日本烟草产业株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年10月18日
【公告号】CA2886908A1, WO2014069339A1