性归属。
[0145] 结果与讨论
[0146] 检出三种蛋白序列，测得均为酮糖-3-差向异构酶蛋白。这些蛋白的序列详见图 1至图3 (序列编号2、4、6)。用作对照者为由解纤维素梭菌H10所得木糖异构酶，先前已提 示该酶可用于由果糖制造阿洛酮糖。其氨基酸序列参见图4 (序列编号8)。
[0147] 将这些蛋白的氨基酸序列与其他已知酮糖-3-差向异构酶的序列对齐，对齐的序 列参见图5。突出显示完整保留的残基。这些序列之间仅有极少保守残基，相邻序列之间保 守残基不足65%。
[0148] 测定了编号2、4、6各序列与登录号NP_535228和BAA24429及序列编号8各序列 之间的序列同一性程度。结果示于表2。对于所选各蛋白序列，所得公知酮糖-3-差向异构 酶序列同一性为40%至63%。基于所有序列的序列比对，并没有整体较强的同源性。所选 蛋白具有经优化的基因，以便为综合构建并克隆于Genscript市售表达载体pET15b的大肠 杆菌所表达。对于每个构建，大肠杆菌BL21 (DE3)的转变取得了成功，并将各株的冷冻储备 物与表达载体一起保存。在1升规模进行了蛋白表达，并采收整个细胞作为粗催化剂。对 转化活性进行检查，并以图6提供了试验期间由4种不同试验株所制造的％DSB阿洛酮糖。
[0149]表 2
[0150]
[0151] 三个假定酮糖-3-差向异构酶均成功表达，而且全部都可将果糖成功转化为阿洛 酮糖，确认每个蛋白确实均为酮糖-3-差向异构酶。
[0152] 活性最强的蛋白为DS P3E(由Desmospora sp. 8437所得D-塔格糖3-差向异构 酶，序列编号6)，该蛋白能利用每升8克湿细胞重量在短短2小时内转化750克/升果糖溶 液的30%，体积产率为112克/升/小时。
[0153]实施例2
[0154] 在本实施例中，以18升规模采用了当前最佳细胞生长和转化条件，用以确定可放 大性，以及制造用于进一步感官和临床试验的阿洛酮糖。转化后，执行了一个初始的净化步 骤，用以去除果糖。本实施例旨在确定本过程的可放大性、放大的任何意外问题，以及可在 实验室中合理制造的阿洛酮糖量。
[0155]
[0156] 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)
[0157] 经过滤除菌的100毫克/毫升氨苄西林水溶液
[0158] 结晶果糖糖蜜
[0159]液体果糖（77 %DS)
[0160] 生长培养基：
[0161]i)将25克氯化钠、25克Staleydex'K 333、6克甘油、50克蛋白胨（Difco)、60克酵 母提取物（Difco)、8克磷酸氢二钾和8克磷酸二氢钾溶于6升去离子水
[0162]ii)用Tris碱（固体）调节pH值至~7. 8
[0163] iii)按每瓶1升装进6个带挡板的2. 8升烧瓶，瓶口包裹铝箔，再热压灭菌
[0164] 1MpH8Tris缓冲液：
[0165]iv)将121克溶于1升去离子水
[0166]iv)用盐酸调节pH值至8
[0167]iv)保存在1升瓶中，再存放在4°C冰箱中
[0168]方法
[0169] 分别按100微克/毫升向6份5毫升LB培养基中添加氨节西林，开始过夜培养， 进行细胞增殖。用大肠杆菌制造菌株（BL21-DE3pET15b-DS-P3E，表达序列编号6的蛋白） 接种培养物，并使其在37°C生长过夜（约16小时）。如上所述配制6升生长培养基并热压 灭菌，向每个烧瓶中添加5毫升过夜培养物，以190转/分在37°C下振荡4小时。新制1份 1M溶液，并按每升添加1毫升IPTG向每个烧瓶中添加ImMIPTG。降温至25°C，继续振荡 14至16小时。
[0170] 使用322型落地式离心机和1升瓶（灌装不超过800毫升培养基），以6000转/分 将培养物离心20分钟，以便收获细胞。将培养基倒入杀桶，再按体积比1 %添加漂白剂，静 置30分钟。对离心管称重，再按每克细胞3毫升向离心管中添加去离子水。使用抹刀和旋 涡振荡器将细胞重新混悬，直到形成均匀细胞浆料。将细胞悬液转移到40毫升离心管中， 并以6500xg重新离心沉降。将洗液倾析到杀桶中，将细胞重新混悬于相同体积的水中。
[0171] 用另外一批细胞重复细胞增殖和收获。
[0172] 将5加仑（18. 9升）桶装结晶果糖糖蜜加热至室温，并将16506克结晶果糖糖蜜加 入经消毒并带有18升校准刻度的5加仑（18. 9L)塑料桶中，配制结晶果糖糖蜜转化基质。 按如上所述配制900毫升1MpH8.OTris溶液，将其加入桶中，然后加水至18升校准标记， 再使用悬臂式搅拌器将其搅匀。将混合物和未使用的结晶果糖糖蜜退回冷藏室中贮存。
[0173] 在经消毒并带有18升校准标记的5加仑（18. 9升）塑料桶中，将17460克液体果 糖（77%DS)与500毫升1MpH8.OTris(如上制备）混合，制得液体果糖转化基质。加水 至18升校准标记，再使用悬臂式搅拌器将其搅匀。
[0174] 对于整个细胞转化，将所制造的18升结晶果糖糖蜜转化基质在水浴中加热至 55°C，再用悬臂式搅拌器以约150转/分轻轻搅拌。添加由细胞收获所得再混悬细胞糊，至 细胞湿重共100克。5小时后采样进行高效液相色谱分析。在4°C冷藏整个桶，以便将反应 停止。取一份样品进行大肠杆菌菌群和TPC微生物分析。
[0175] 用制造的18升液体果糖转化基质重复整个细胞转化过程。使用湿重为120克的 细胞，并在2小时和4小时采样进行高效液相色谱分析。
[0176] 以酵母发酵去除结晶果糖糖蜜转化基质中的果糖。用2倍体积水稀释结晶果糖糖 蜜转化产物，使54升总体积中阿洛酮糖和果糖值的合并最终浓度为~250克/升。将54 升稀释混合物分装到4个经消毒的5加仑（18.9升）桶中，每桶约装13升。将其中两个 桶保存在冰箱中。分别将其余两个桶设置为用悬臂式搅拌器剧烈搅拌，并用配备扩散器的 9升/分空气泵通气，以便得到约0. 3VVM的气流。向每个桶中添加120克面包活性干酵母 (Fleishman品牌），搅拌并通气2天（~36小时），不时采样进行DP1-4阿洛酮糖分析。将 桶转移到冷藏室过夜，使酵母沉降。然后取上清液，转移到两个新的洁净并经消毒的桶中， 将其余酵母部分转移到两个装有以上准备的冷藏结晶果糖糖蜜的桶中。重复搅拌及混合过 程中，然后去除酵母。在酵母发酵步骤之后，得到约45升上清液，并无菌过滤到3个清洁并 经消毒的桶中，然后贮存于4°C供后续处理。
[0177] 结果与讨论
[0178] 由12升培养物得到约220克此21(0￡3^￡1'-1513-03?3￡细胞，并分成2份用于上 述两个18升规模的生物转化。因此，对于结晶果糖糖蜜转化，全细胞生物催化剂总浓度为 5. 6克/升，对于液体果糖转化，为6. 7克/升。
[0179] 图11表明：这两种转化迅速达到~25%，以阿洛酮糖占阿洛酮糖+果糖的百分比 计。这略低于之前用这类细胞和类似转化介质在小规模达到的转化水平，但二者非常接近。 使用液体果糖基质时，短短2个小时后转化率就已达到22%。
[0180] 在各18升的转化规模，产出了约3. 3千克阿洛酮糖。两种基质之间似乎没有显著 差异。
[0181]从250毫升放大并未产生任何不可预见的问题，而且是按预期进行。
[0182] 微生物检查结果表明：没有活大肠杆菌，结果呈阴性，每克< 3个大肠菌群，总平 板计数为两个。因此，55°C的温度结合高DS比例的糖浆足以杀死全细胞生物催化剂。
[0183] 使用新发现的DSP3E酶，将果糖向阿洛酮糖的生物转化成功放大至18升。
[0184]实施例3
[0185] 采用pH控制进料分批培养方法及葡萄糖酵母提取物培养基，在发酵实验室中以 两个10升规模的发酵，制造了含新发现的DSP3E蛋白（编号6)的大肠杆菌菌株。发酵按 预期进行。
[0186] 在发酵批增长及补料分批阶段，细胞呈指数式增长，其倍增时间约为1小时。在约 5. 5小时中，葡萄糖浓度由约9克/升下降至< 1克/升（0D~28)。在产酶诱导期，0D继 续上升至约130,随后未观察到明显变化。经离心对发酵进行采收，得到4.5千克（10镑） 湿细胞糊，干细胞重约为1. 1千克（2. 5镑）。
[0187]用反渗透水将果糖基质（836千克，以DS(干固物）计）稀释至69%DS(920克/ 升），并加热到52°C，并将pH值调到7. 8。在整个反应过程中采用低速搅拌（约50转/分） 促进混合，并将整批4. 5千克（湿糊）以上所得表达全细胞加入反应，取1份0时样品。这 提供了 〇. 48克/升的生物催化剂负荷，与先前测试的实验室规模转化类似，然而，其基质浓 度较高，为920克/升。在4和16小时采样以高效液相色谱进行了分析。
[0188] 在反应期间未发现DS下降，而且没有生成生物制品。在16小时反应结束时，反应 进行到接近平衡，即约30%阿洛酮糖。在4小时时反应已经进行到转化18%。之前使用0. 5 克/升生物催化剂及750克/升基质（实施例1和实施例2)所得体积转化率是46克/升 *小时，或每单位生物催化剂92克/升*小时/克生物催化剂。在这里，采用较高的基质浓 度和略低的温度（52°C相对于55°C)，体积转化率为41克/升*小时或85克/升*小时/ 克生物催化剂（用4小时的数据点计算）。这表明异构酶反应具有相当大的灵活性。当在 16小时完成反应后，在28 : 72的阿洛酮糖：果糖混合物中有230千克阿洛酮糖。
[0189]实施例4
[0190] 在750克/升Tris缓冲的果糖基质上，对用4种不同酶（序列编号：2、4、6、8)进 行的果糖转化进行了比较。在16°C而不是25至30°C诱导细胞，而转化速率比以前的实验 慢。在500毫升带挡板的烧瓶中，向200毫升基质中添加湿重为2克的再混悬细胞，然后在 55°C及90转/分条件下培养。在2小时和3. 5小时米样进行高效液相色谱分析。结果参 见图12,其中，CCP3E对应于编号8的序列，CHP3E、CSP3E及DSP3E则分别对应于编号 4、2及6的序列。在该实验中，表达序列编号2、4、6或8所述蛋白的全部4株显不具有大致 相同的活性，