在3. 5小时将约5%基质转化为阿洛酮糖。
[0191]实施例5
[0192] 在本实施例中，使用固定化酶进行了制造阿洛酮糖的首次试验。本实施例的目的 在于提高酶利用率。
[0193] 物赳
[0194]Codexis制备的冻干酶粉末，批号：D13007或D13008
[0195] -Desmospora sp?阿洛酬糖_3_差向异构酶
[0196]DuoliteA568 (Doff)
[0197]AmberliteXAD2 (Sigma)
[0198] 1MTris缓冲液：
[0199]i)以1M的浓度溶于水而制备
[0200] ii)用盐酸将pH值调到8. 0
[0201] iii)使用前稀释至lOOmM
[0202] 结晶果糖糖蜜，80%干固物，其组成为：
[0203]i)90%DSB果糖
[0204]ii)7%DSB葡萄糖
[0205]iii)3%DP2+
[0206]iv)其他单糖
[0207]MnCl2 (Sigma)
[0208]方'法
[0209] 1)小规模固定化
[0210] 为了试验固定效率，在约30毫升容积（色谱柱尺寸为11毫米x300毫米）的夹 套柱中进行了小型固定床反应。用水对XAD2和A568树脂进行数次洗涤，以除去制造过程 的细小树脂颗粒（即树脂制备的副产物细树脂颗粒（即断裂/破碎颗粒））及任何残留物。 将2克冻干酶（即差向异构酶）溶于约50毫升水，并分成两等份。测定pH值，结果为6.5。 分别取各树脂约30毫升，在室温及轻微搅拌条件下与1份差向异构酶溶液一起培养约1小 时，然后将树脂填装到夹套柱中，再用蠕动泵经固定床将差向异构酶溶液循环2小时。然后 用10倍柱床体积的l〇〇mMpH8.OTris缓冲液洗涤柱子。在这个点，在A280进行分光亮度 法测定时，洗脱液澄清不含蛋白。用反渗透水将结晶果糖糖蜜稀释到60%DS，随后将pH调 至8. 0,然后添加28ppmMnClJPlOmMpH8.OTris缓冲液，以制备结晶果糖糖蜜进料。
[0211] 用循环水浴将夹套柱加热至57°C，并以8倍柱床体积/小时（BV/小时）的速率将 进料泵过30毫升固定床反应器。收集反应器洗脱液，用FT-IR进行分析，以便提供阿洛酮 糖和果糖的相对浓度。该过程共持续5天。在试生产过程中，将进料速率从8倍柱床体积 /小时调到6倍柱床体积/小时，以保持转化速率。
[0212] 2.放;.大.至300毫升固定床反.应器
[0213] 为了试验固定的放大效率，用约300毫升容积（色谱柱尺寸为25毫米x600毫米） 的夹套柱创建了较大的固定床反应器。用水对XAD2和A568树脂进行数次洗涤，以去除细 小颗粒和制造过程的任何残留物。将10克冻干差向异构酶溶于约100毫升水。将约300 毫升A568树脂填充于300毫升夹套柱，在室温下用蠕动泵经固定床将差向异构酶溶液循环 约2小时。然后，在室温下，用5倍柱床体积的100mMpH8.OTris缓冲液洗涤柱子。在这 个点，在A280进行分光亮度法测定时，洗脱液澄清不含蛋白。用反渗透水将结晶果糖糖蜜 稀释到60%DS，随后将pH调至8. 0,然后添加28ppmMnCljP10mMpH8.OTris缓冲液，以 制备结晶果糖糖蜜进料。用循环水浴将夹套柱加热至57°C，并以8倍柱床体积/小时（BV/ 小时）的速率将进料泵过30毫升固定床反应器。收集反应器洗脱液，用FT-IR进行分析， 以便提供阿洛酮糖和果糖的相对浓度。该过程共持续4天。在试生产过程中，将进料速率 从8倍柱床体积/小时调到2倍柱床体积/小时。另外，将该柱在室温下静置2周时间，然 后重新启动，以测定差向异构酶在柱贮存期间的稳定性。
[0214] 结果与讨论
[0215] 对于任何检查样品，30毫升柱及XAD2未出现显著转化，因此，未进行进一步分析。 然而，采用DowexA568则发现了显著转化。图13所示为30毫升固定床反应器及A568树 脂的反应时程。在仅含1克差向异构酶的120小时固定床转化期间，制造了超过4千克阿 洛酮糖。在120小时期间，百分转化逐渐降低，因此在72小时降低了经柱流量，用以补偿转 化率的降低。反应期间产生了近乎平衡的阿洛酮糖浓度。
[0216] 图14所示为使用A568树脂的300毫升反应过程。由于进料量受限（72小时内用 86升进料），在24小时降低了流量。在72小时内，由10克差向异构酶产生了超过20千克 阿洛酮糖。在72小时末，转化率仍然很高，虽然发现性能有所下降。
[0217] 先前已在烧瓶反应中确定差向异构酶在溶液中的稳定性。在53°C下8小时内损 失了超过90%的活性。在该实施例中，在57°C下进行了转化。较高温度的优势在于反应速 率、平衡比，以及微生物稳定性。在该实施例中，即使在120小时后，仍然保持了显著的差向 异构酶活性。
[0218] 在进料受限的大规模反应中，使用10克差向异构酶产出了20千克阿洛酮糖，所得 差向异构酶净投料比为0.05% (质量/质量）。在小规模反应中，使用1克差向异构酶产 出了 4. 8千克阿洛酮糖，所得差向异构酶净投料比为0.02% (质量/质量）。在标准果糖 制造中，尽管是在6至12个月的操作过程中，按0. 01 %至0. 005%的比例（质量/)使用了 固定化葡萄糖差向异构酶。
【主权项】
1. 一种包含多肽序列的蛋白，该多肽序列与编号6的序列、编号2的序列或编号4的序 列具有至少70%的序列同一性，其特征在于，该蛋白具有酮糖-3-差向异构酶活性。2. 根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，该多肽序列与编号6、编号2或编号4的 序列具有至少80%、90%、95%或99%的序列同一性，或100%的序列同一性。3. 根据权利要求1或2所述的蛋白，其特征在于，该多肽序列包含编号13的序列。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其特征在于，该蛋白固定于固相基质。5. 如前述权利要求中任一项所述的蛋白用于合成阿洛酮糖的用途。6. -种核酸分子，所述核酸分子包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码权利要求1 至4中任一项所述的蛋白。7. 根据权利要求6所述的核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列 的特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%的序列同 一性，或100 %的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或 编号3所示序列互补的序列。8. -种载体，该载体包含根据权利要求6或7所述的核酸分子。9. 一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求6或7所述的重组核酸分子。10. 根据权利要求9所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种酵母、细菌或其他微生 物，或是哺乳动物、植物或其他细胞的培养物。11. 根据权利要求10所述的宿主细胞，其中该宿主细胞为大肠杆菌。12. 根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白制造的阿洛酮糖。13. -种制造阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括在可将果糖基质转化成阿洛酮糖的条 件下将根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白与果糖基质接触。14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，该蛋白存在于宿主细胞中。15. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，该蛋白呈分离形式。16. 根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中该条件包括将蛋白和果糖基质保 持在25°C至75°C之间。17. 根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中该条件包括将蛋白和果糖基质保 持在pH4至pH10之间。18. 根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中该条件包括将果糖基质的浓度保 持在75%至95% (重量/体积）之间。19. 一种核酸分子，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列的特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与编号5、编号1 或编号3所示序列互补的序列。20. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含重组核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，该多核苷酸序列其特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或 编号3所示序列互补的序列。21. -种载体，所述载体包含核酸分子，该核酸分子包含多核苷酸，该多核苷酸编码具 有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，其中该多核苷酸序列的特征在于： (i)与编号5、编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或 (ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或 编号3所示序列互补的序列。22. -种制造阿洛酮糖的方法，该方法包括以下步骤： (i)提供一种包含核酸分子的载体，该核酸分子具有多核苷酸序列，该多核苷酸序列 编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白，其中该多核苷酸序列的特征在于：(a)与编号5、 编号1或编号3的序列具有至少70%的序列同一性；或（b)在高度严谨条件下杂交得到多 核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1或编号3所示序列互补的序列； (ii)合成具有酮糖-3-差向异构酶活性并被多核苷酸序列编码的蛋白； (iii) 将果糖与具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白接触，并将果糖和蛋白保持在可将 果糖转化成阿洛酮糖的条件下；以及 (iv) 至少对步骤（iii)所制造的阿洛酮糖进行部分纯化。
【专利摘要】一种包含多肽序列的蛋白，该多肽序列与编号6、编号2或编号4的序列具有至少70％的序列同一性。该蛋白具有酮糖-3-差向异构酶活性。
【IPC分类】C12P19/02, C12P19/24, C12N9/90
【公开号】CN104903457
【申请号】CN201380050744
【发明人】R·D·伍德耶尔, R·W·阿门特劳特
【申请人】泰特&莱尔组分美国公司, 塔特和莱利技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年9月27日
【公告号】CA2886514A1, EP2900827A1, US20150210996, WO2014049373A1