含1毫升D-果糖（50 克/升）、Tris-HCL缓冲液（50mM，pH8. 0)，以及0. 5yM酶的反应混合物在55°C培养2分 钟。在10分钟后通过煮沸来停止反应。用高效液相色谱法（HPLC)测定所得D-阿洛酮糖 量。将一个酶活性单位定义为在pH8. 0及55°C条件下每分钟催化形成1ymolD-阿洛酮 糖的酶量（J.Agric.FoodChem. 2011，59, 7785-7792)。
[0051] 术语"基因"、"多核苷酸"和"核酸分子"在本文中可互换使用，用于指代多核苷酸 聚合物。核酸分子可能会含有天然存在的核酸（DNA或RNA)，或包含人工核酸，例如：肽核 酸、吗啉和锁核酸以及乙二醇核酸和苏糖核酸。
[0052] 本文所用术语"核苷酸"指天然存在的核苷酸，以及可被细胞酶识别的合成核苷酸 类似物。
[0053] 本文所用术语"载体"指含一种核酸分子的任何天然或人工构建，其中，核酸分子 可被细胞转录酶和/或翻译酶催化。示例载体包括：质粒、病毒（包括噬菌体）、粘粒、人工 染色体或转座子。
[0054] 本文所用术语"宿主细胞"指任何可在培养基中培养并用于表达重组基因的生物 细胞。这些宿主细胞可以是真核或原核细胞，也可以是微生物如细菌细胞，或者可以是来源 于一个细胞系的细胞（如哺乳动物永生细胞系）。
[0055] 本文所用术语"高度严谨的条件"在指杂交条件时，指：在65°C条件下至少约6倍 SSC和1%SDS，在约42°C用在0? 1倍SSC中配制的约20% (体积/体积）甲酰胺首次洗涤 10分钟，随后在65°C条件下用0. 2倍SSC和0. 1%SDS洗涤。在诸如本说明书所述的高度 严谨条件下，使用公知的核酸作为探针的杂交技术将识别结构相似的核酸，这是本领域的 公知技术。
[0056] 本文所用术语"阿洛酮糖"指具有式（I)所示结构的单糖。其亦称为"D-阿洛酮 糖"。
[0057]
[0058] 本文所用术语"果糖"指具有式（II)所示结构的单糖。果糖基质实例包括但不限 于结晶果糖和结晶果糖糖蜜。本文所用术语"结晶果糖糖蜜"指果糖从结晶母液的非结晶 部分结晶期间产生的工艺流体。
[0059]
[0060] 本文所用术语"重组"指位于非天然发生的环境，并经人工干预而制备的核酸分子 或多肽。重组多肽的例子包括，从其他多肽中分离的第一多肽，或是经肽键连结到第二多肽 序列的第一多肽，而其中所述第二多肽的氨基酸序列与第一多肽在自然界中相关联的任何 多肽不同。
【附图说明】
[0061] 图1所示为如本发明的实施例，由闪烁梭菌（Clostridiumscindens)所得酮 糖-3-差向异构酶的氨基酸序列（序列编号2)。
[0062] 图2所示为如本发明的另一实施例，由海氏梭菌（Clostridiumhylemonae)所得 酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列（序列编号4)。
[0063] 图3所示为如本发明的又一实施例，由Desmosporasp.所得酮糖-3-差向异构酶 的氨基酸序列（序列编号6)。
[0064] 图4所示为由解纤维素梭菌（Clostridiumcelluloyticum)所得的先前已知木糖 异构酶的氨基酸序列（序列编号8)。
[0065] 图5示出了由图1至图3所示的三个酮糖-3-差向异构酶和之前已知的三个酮 糖-3-差向异构酶的序列对比，并突出显示完整保留的残基。
[0066]图6所示为经转化的大肠杆菌使果糖转化为阿洛酮糖的转化率曲线，其中大肠杆 菌的转化为表达本发明实施例所述一种酶和一种对照。
[0067] 图7所示为编码图4所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号7)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0068] 图8所示为编码图3所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号5)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0069] 图9所示为编码图1所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号1)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0070]图10所示为编码图2所示氨基酸序列并经优化的基因序列（序列编号3)，以及经 优化序列与原始序列的比较。
[0071] 图11所示为经转化的大肠杆菌使果糖基质转化为阿洛酮糖的转化制备图，大肠 杆菌的转化为以18升的规模表达本发明实施例所述一种酶（由Desmosporasp所得酮 糖_3_差向异构酶）。
[0072] 图12所示为以本发明实施例的酶（CHP3E、CSP3E和DSP3E)和一种已知酮 糖-3-差向异构酶（CCP3E)催化的阿洛酮糖转化率曲线图。
[0073] 图13所示为在填充A568树脂的30毫升固定床反应器中以DSP3E催化的阿洛酮 糖转化率曲线图。
[0074] 图14所示为在填充A568树脂的300毫升固定床反应器中以DSP3E催化的阿洛 酮糖转化率曲线图。
[0075] 图15所示为由Desmosporasp.所得的天然存在的酮糖-3-差向异构酶其一种人 工变体的氨基酸序列（序列编号13)。
[0076] 序列清单之简要说明
[0077] 序列编号1所示为编码由闪烁梭菌所得的酮糖-3-差向异构酶的基因序列（为在 大肠杆菌中表达而优化）。
[0078] 序列编号2所示为由编号1的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0079] 序列编号3所示为编码由海氏梭菌所得的酮糖-3-差向异构酶的基因序列（为在 大肠杆菌中表达而优化）。
[0080] 序列编号4所示为由编号3的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0081] 序列编号5所示为编码由Desmosporasp. 8437所得酮糖-3-差向异构酶的基因 序列（为在大肠杆菌中表达而优化）。
[0082] 序列编号6所示为由编号5的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0083] 序列编号7所示为编码由解纤维素梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的基因序列（为 在大肠杆菌中表达而优化）。
[0084] 序列编号8所示为由编号7的基因序列所编码酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序 列。
[0085] 序列编号9所示为编码由闪烁梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的天然存在基因序 列。
[0086] 序列编号10所不为编码由海氏梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的天然存在基因序 列。
[0087] 序列编号11所示为编码由Desmosporasp. 8437所得酮糖-3-差向异构酶的天然 存在基因序列。
[0088] 序列编号12所示为编码由解纤维素梭菌所得酮糖-3-差向异构酶的天然存在基 因序列。
[0089] 序列编号13所示为Desmosporasp. 8437的酮糖-3-差向异构酶其人工变体的氨 基酸序列。
【具体实施方式】
[0090] 总体而言，本发明涉及一种包含多肽的蛋白，所述多肽具有序列编号2、4或6所示 的氨基酸序列。序列编号2、4、6的多肽的源生物如表1所示。
[0091] 表 1
[0092] L/1N丄 I n ^ 1/丄djy、
[0093] 然而，在其他实施例中，该多肽序列与序列编号2、4、6所示并不完全相同，但与其 有至少70 %的序列同一性。优选地，该多肽序列与序列编号2、4或6有至少80 %、90 %、 95%或99%的序列同一性，或100%的序列同一性。
[0094] 例如，在一个实施例中，多肽序列包括序列编号13的序列，其与编号6的序列有 89%的序列同一性。该多肽序列具有酮糖-3-差向异构酶活性。
[0095] 因此，在一些实施例中，将肽的一个或多个氨基酸删除，或是用不同氨基酸取代， 优选用相似的氨基酸取代。相似的氨基酸为侧链部分有相关属性的氨基酸，而天然存在的 氨基酸可分为下列基团。具有碱性侧链的基团：赖氨酸、精氨酸、组氨酸。具有酸性侧链至 基团：天门冬氨酸和谷氨酸。具有不带电荷极性侧链的基团：天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏 氨酸和酪氨酸。具有非极性侧链的基团：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸和半胱氨酸。因此，优选取代具有此等基团的氨基酸。
[0096] -般优选多肽与天然存在多肽（尽管其也可体外合成）的化学性质相符，但在其 他一些实施例中，多肽为拟肽类，也即以非自然发生的方式修饰的多肽。此等拟肽类包括用 合成的氨基酸取代天然存在的氨基酸和/或修饰多肽的主链。例如，在一些实施例中，肽键 为反向肽键所取代，以生成一个向后反转的拟肽（参见本文所含参考文件M6zi6re等人，J Immunol. 19970ct1;159(7):3230-7)。另外，氨基酸经共价键而非肽键相连，但形成聚合 物链的氨基酸残基保持其间距和取向。
[0097] 本发明中所有这类修饰及未修饰多肽都具有酮糖-3-差向异构酶的聚合酶活性。 也即经纯化或在宿主细胞中表达的蛋白能催化果糖向阿洛酮糖的转化。检验酮糖-3-差向 异构酶活性的适宜条件如实施例1所示。
[0098] 本发明的多肽可包含于一个完整细胞内，或为经分离的蛋白、经部分纯化的蛋白， 或经固定的蛋白。蛋白纯化可经标准的方法，如细胞破碎和过滤。其他标准方法亦为本技 术领域技术人员所知。
[0099] 本发明的实施例提供了一种包含多核苷酸序列的核酸分子，所述多核苷酸序列编 码一种蛋白，所述蛋白的氣基酸序列与序列编号2、4或6的序列有至少70%的序列同一性， 所述蛋白具有酮糖-3-差向异构酶活性。例如，在一个实施方案中，核酸分子所含序列编码 编号13的多肽序列。
[0100] 除特别编码本发明所述蛋白的序列外，核酸分子可包含其他序列，例如引物位点、 转录因子结合位点、载体的插入位点和抗溶核降解的序列（例如：多聚腺苷尾）。所述核酸 分子可为DNA或RNA，并可包括合成的核苷酸，前提是多核苷酸仍能被翻译用于合成本发明 的蛋白。
[0101] 如上所述，本发明的蛋白的氨基酸序列可以不同于本文所公开的特定序列。在优 选实施方案中，所述核酸分子包含具有序列编号1、3或5的序列的多核苷酸，所述多核苷酸 在大肠杆菌宿主细胞中表达而经优化。在其他实施例中，所述多核苷酸序列与编号1、3或5 之中任一序列有至少70%的序列同一性，并编码具有酮糖...