-3-差向异构酶活性的蛋白。优 选地，该多肽序列与编号1、3或5之中一个序列有至少80%、90%、95%或99%的序列同一 性，或100 %的序列同一,性。在其他实施例中，核酸分子包含一种多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，其具有与编号1、3、5所示序列互补的序 列，并编码具有酮糖-3-异构酶活性的蛋白。在一些实施例中，提供了一种核酸分子，其所 包含具有编号9、10或11的序列的多核苷酸，所述多核苷酸是酶的天然存在的序列。
[0102] 在一些实施例中，所述核酸分子为载体（如质粒）的组成部分。除上述核酸序列 外，该质粒亦包含其他元素，例如原核覆制起点（例如大肠杆菌0R1复制起点）、自主复制序 列、着丝粒序列；位于核酸序列上游的启动子序列、位于核酸序列下游的终止子序列、抗生 素抗性基因和/或分泌信号序列。包含自主复制序列的载体亦为酵母人工染色体。
[0103] 在其他一些实施例中，载体为病毒，如噬菌体，而且除包括本发明的核酸序列外， 还包括用于噬菌体复制的核酸序列，如结构蛋白、启动子、转录启动子等。
[0104] 本发明的核酸分子可用于转染或转化宿主细胞，以便合成本发明的蛋白。适宜的 宿主细胞包括原核细胞如大肠杆菌，以及真核细胞如酵母细胞，或哺乳动物或植物细胞系。 宿主细胞的转染或转化是使用本领域的公知技术，如电穿孔、磷酸钙基方法、基因枪技术， 或使用病毒载体。
[0105] 本发明的核酸分子转染后，再根据需要转录和翻译。在一些实施例中，可将合成的 蛋白保持在宿主细胞中，随后可使用重组宿主细胞的培养物。在其他实施例中，例如由于载 体中存在分泌信号而将合成的蛋白从细胞中分泌出来，或裂解宿主细胞并纯化所得蛋白， 以这些方法将合成的蛋白从宿主细胞中提取出来。
[0106] 用本发明的蛋白催化果糖向阿洛酮糖的转化。在一些实施例中，该蛋白存在于宿 主细胞中，并以1至1000克/升的浓度在适当条件（如从25°c至75°C的培养温度，从4至 10的pH值）下，与果糖基质如用硼酸盐缓冲的果糖基质混合，以形成转化混合物。转化混 合物也可包含溶剂和其他可选共溶剂（除水外）例如乙醇、甲苯和甲醇。果糖基质也可包 含其他糖，如葡萄糖或蔗糖。所述蛋白可催化果糖基质向阿洛酮糖的转化。实际上，转化混 合物中所有果糖并非都转化为阿洛酮糖，因此通常随后有一个提取阿洛酮糖及经蒸发和结 晶而纯化的步骤。该混合物中剩余的果糖可经酵母发酵而去除。
[0107] 在其他实施例中，本发明的蛋白以经纯化的形式提供，并与果糖基质及适宜溶剂 一起混合，用于在体外完全转化。在一个实施例中，条件为pH4至10,温度30°C至70°C，果 糖浓度为10%至95% (重量/体积），溶剂为水。果糖的可选浓度范围包括但不限于20% 至95%、30%至95%、40%至95%、50%至95%、60%至95%、70%至95%、75%至95%。 特别优选的果糖基质浓度范围为70%至95%之间。在其他优选实施方案中，果糖浓度为 75%至 95%。
[0108] 酮糖的转化反应通常使用1%至60% (重量/体积），优选约5%至50%的基质浓 度。本发明的特别优点在于，可采用常规操作条件但高于以往的果糖浓度，将蛋白用于酮糖 转化反应。因此，用本发明的蛋白可能达到较大的体积产率。
[0109] 在一些实施例中，本发明的蛋白固定于固相基质。其优点在于，这种酶的使用寿命 更长，可填装到小固定床反应器中，而且对污染物及过程条件的波动有更大的耐受性。示 例的固体基质包括离子交换树脂和聚合物封装。在一些实施例中，本发明的蛋白固定于 DuoliteA568树脂。在一些实施例中，用弱碱性离子交换（即基于蛋白电荷与基质诸如树 脂电荷的静电相互作用）将本发明的蛋白固定于一种基质。在其他实施例中，将蛋白非特 异性结合至基质诸如树脂的多孔区域，从而将其固定。
[0110] 在另一个实施例中，本发明涉及一种制造阿洛酮糖的方法。该方法包括以下步骤。
[0111] 1)提供一种包含核酸分子的载体，所述核酸分子与编号1、编号3或编号5的序列 有至少70%的序列同一性。
[0112] 2)用所述载体转化感受态宿主细胞。
[0113] 3)可选地，培养所转化的宿主细胞。
[0114] 4)将所转化的细胞与果糖基质混合并保持在可将果糖转化为阿洛酮糖的条件下。
[0115] 5)用本领域的标准方法如蒸发和结晶，纯化所得阿洛酮糖。
[0116] 在其他实施例中省略了步骤4)。取而代之，将所述核酸分子编码的蛋白从经转化 的宿主细胞中分离出来，并可选地将其固定于基质。然后将所述蛋白与果糖基质混合并保 持在可将果糖转化为阿洛酮糖的条件下。然后执行步骤5)。在其他实施例中，省略了步骤 2)，并且蛋白亦由体外翻译而合成。接着将蛋白分离并与果糖基质混合。
[0117] 以本发明所述方法制造的阿洛酮糖可用于供人和/或动物消费的产品。在一些实 施例中，产品可能是食品、饮料、药品、营养产品、运动产品，或化妆品。例如，当该产品为食 品时，食品可选自糖果产品、甜食产品、谷类产品、焙烤食品、冷冻乳制品、肉类、乳制品、调 味品、点心棒、汤、酱、调配品、预制食品、婴儿食品、饮食制剂、糖楽?、食品涂料、干果、调料、 肉汁和果酱/果冻。在一些实施例中，所述食品会包含以本发明所述方法制造的阿洛酮糖， 作为产品表面的涂层或形成的粉霜。
[0118] 可选地，当该产品是一种饮料产品，该饮料产品可选自碳酸饮料、非碳酸饮料、水 果味饮料、果汁、茶、奶、咖啡和类似饮料。
[0119] 实施例
[0120]实施例1
[0121] 在本实施例中，宿主细胞经转化以表达三个假定酮糖-3-差向异构酶之一。将经 转化的宿主细胞与果糖基质共同培养，以测试其酮糖-3-差向异构酶活性。
[0122] 物赳
[0123] 1MpH8硼酸盐缓冲液：
[0124] i)将62克硼酸溶于1升去离子水
[0125] ii)用10M氢氧化钠溶液调到pH8
[0126] iii)保存在1升瓶中，再存放在4°C冰箱中
[0127] 用硼酸盐缓冲的果糖基质：
[0128] i)将970克液体果糖（77%DS)与50毫升pH8硼酸盐缓冲液混合
[0129] ii)加水至最终体积为1升
[0130] iii)用5M氢氧化钠溶液调节pH值至8
[0131] 表达培养基LB-4X2. 8升带挡板的摇瓶：
[0132] i)将10克胰胨、7克氯化钠和10克酵母溶于1升去离子水
[0133]ii)热压灭菌
[0134] 方法
[0135] 选择三种假定酮糖-3-差向异构酶基因序列和一种对照序列以通过Genscript USA合成构建。假定的酮糖-3-差向异构酶序列编码：
[0136] i)由闪烁梭菌ATCC 35704(登录号ZP_02432281)所得假定蛋白 CL0SCI_02526(序列编号2)
[0137] ii)由海氏梭菌DSM 15053(登录号ZP_03778576. 1)所得假定蛋白 CL0HYLEM_05645(序列编号4)
[0138] i i i)由Desmospora sp. 8437(登录号ZP_08466075)所得D-塔格糖3-异构酶（序 列编号6)。
[0139] 对照序列编码由解纤维素梭菌H10 (登录号YP_002505284)所得木糖异构酶蛋白 (序列编号8)。
[0140] 用为在大肠杆菌中表达而优化的序列（请参阅图7至图10)，对基因进行合成构 建，并将所得4个基因分别克隆到表达载体pET15b中。本领域技术人员所知微生物和表达 载体的其他组合预期同样表现出色。
[0141]用大肠杆菌BL21 (DE3)接种3毫升溶源性肉汤（LB)，并在37°C过夜使细菌增殖， 从而制备用于转化的感受态细胞。用这3毫升培养液接种300毫升LB，并在37°C振荡，使 细胞生长到0D(600)为0. 7至1. 0。用典型分光亮度计在600nm波长处测定1厘米比色皿 中的光密度（0D值）。将细胞放在冰上冷却10分钟，然后在4°C下以7500xg离心沉降15 分钟。倒出培养基，将细胞重新混悬于300毫升冷水。重复离心，再将细胞重新混悬于150 毫升冷水。再次重复离心，再将细胞混悬于约2毫升冷却的10%无菌甘油。如上述方法将 细胞离心沉降，再混悬于约2毫升冷却的10 %无菌甘油。将该混悬液按100y1等分分装到 无菌离心管中，并贮存在-80°C。
[0142] 随后，将Genscript供应的表达载体用于以电穿孔法转化感受态大肠杆菌 BL21 (DE3)，并在含氨苄西林的LB琼脂上选择阳性转化株。分别将1升LB倒入4个2. 8升 带挡板的烧瓶中并高压灭菌。冷却后，在无菌条件下向每个烧瓶中添加1毫升100毫克/ 升氨苄西林，再用2至3毫升上述制备的感受态细胞过夜培养物接种每个烧瓶（每个表达 菌株1个烧瓶）。使细胞在37°C200转/分条件下生长约3小时，以便0D达到0. 8至1. 5。 向每个烧瓶中添加1毫升新制1M异丙基--D-1-硫代半乳糖苷溶液中，将温度降至室温 (即25至30°C)，诱导反应继续进行约5小时。在4°C以约5000xg将细胞离心沉降30分 钟，倾出上清液。将细胞沉淀转移到已称重的50毫升离心管中，并记录细胞质量。将细胞 重新混悬于几毫升无菌甘油（10%重量/重量），并冷冻于_80°C。
[0143] 将全细胞与经硼酸盐缓冲的果糖基质混合，以DP1-4方法并使用钙2+色谱柱，用 高效液相色谱（HPLC)法进行分析，检查细胞的转化活性。将装有250毫升经硼酸盐缓冲的 果糖基质的4个烧瓶加热至55°C，并在室温下将冷冻细胞解冻。以6500xg对细胞进行离 心沉降，再重新混悬于去离子水。将2克（湿重）细胞与经硼酸盐缓冲的果糖基质混合，并 在55°C及90转/分搅拌条件下在1升带挡板的烧瓶中培养。在0、1、2和5小时采样进行 高效液相色谱分析。
[0144] 高效液相色谱分析包括将20微升0? 1 % (重量/体积）供试品注入色谱系统，用 水作为流动相，流速为〇. 1至1. 5毫升/分，固定相为粒径1至10微米的Ca2+形式的树脂， 柱温为80°C。以示差折光检测器对峰进行检测和定量，并基于已知标准品的保留时间进行 定