用于酶促水解木质纤维素材料的方法
【专利说明】用于酶促水解木质纤维素材料的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及用于酶促水解木质纤维素材料的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 木质纤维素植物材料在本文中也称为原料（feedstock)或含纤维素材料，其是糖 形式的可再生能源，其可被转化为有价值的产物，例如生物燃料，例如生物乙醇。该过程期 间，通过（半）纤维素分解酶，原料（例如麦秸、玉米杆、稻壳等）中存在的（木质或半）纤 维素被转化为还原糖，然后通过微生物（比如酵母、细菌和真菌）被转化为有价值的产物例 如乙醇。
[0004] 鉴于（半）纤维素是结晶的并包埋在木质素网中，向还原糖的转化通常是慢的且 不完全的。典型地，酶促水解未处理原料产生少于理论量的20%的糖。通过应用化学和热 物理预处理，（半）纤维素对（半）纤维素分解酶而言更可及，因而转化更快且产率更高。
[0005] 来自源于经预处理玉米杆的葡萄糖的典型乙醇产率是40加仑乙醇/1000kg干玉 米杆（Badger，P，Ethanol from cellulose ：a general review,Trends in new crops and new uses，2002, J.Janick 和 A. Whipkey (编）ASHS Press，Alexandria，VA)或 0.3g 乙醇 / g原料。基于纤维素的乙醇的最大产率是约90%。
[0006] 纤维素分解酶（它们中的大多由比如Trichoderma、Humicola和Aspergillus的 物种产生）在商业上被用来将预处理的原料转化为含有不可溶的（半）纤维素、其制得的 还原糖以及木质素的糊状物（mash)。然后，这种糊状物被用在发酵中，发酵期间还原糖被转 化为酵母生物质（细胞）、二氧化碳和乙醇。以这种方式产生的乙醇被称为生物乙醇。
[0007] 从预处理的木质纤维素原料生产糖的一般生产中，水解（还被称为 液化、预糖化或糖化）典型地在45-50 °C的升高的温度（Kumar，S.，Chem. Eng. Technol. 32(2009)517-526)和非灭菌条件下的持续6-168小时的方法中进行（Kumar， S. , Chem. Eng. Technol. 32(2009)517-526 ；Murray, P.等人，Enzyme Microbial Technol 29(2001)90-98)。在该水解期间，存在的纤维素被部分（典型地30-95%，可取决于酶活性 和水解条件）转化为还原糖。在酶被预处理原料中存在的化合物和被释放的糖抑制的情况 下，以及为了使热失活最小化，该升高的温度的时间尽可能地短。
[0008] 水解后的发酵在相同或不同容器中在单独的厌氧处理步骤中发生，其中温度被调 至30-33°C (嗜温方法）以适应生长和通过微生物生物质（通常为酵母）生产乙醇。在 该发酵方法期间，通过来自水解步骤的已存在的酶，剩余的（半）纤维素材料被转化为还 原糖，同时产生微生物生物质和乙醇。因此，这种类型的发酵通常被称为同时糖化和发酵 (Simultaneously Saccharification and Fermentation，SSF) 〇 -旦（半）纤维素材料被 转化为可发酵糖并且所有可发酵糖被转化为乙醇、二氧化碳和微生物细胞，发酵完成。
[0009] 这样获得的发酵糊状物由非可发酵糖、非可水解（半）纤维素材料、木质素、微生 物细胞（最通常为酵母细胞）、水、乙醇、溶解的二氧化碳组成。在连续步骤中，从糊状物中 蒸馏并进一步纯化乙醇。剩余的固体悬浮物被干燥并被用作例如燃烧燃料、肥料或牛饲料。
[0010] 就每批原料而言，添加酶以使给定的处理时间期间从预处理的木质纤维素原料释 放可发酵糖的产率和速率最大化。通常，生产酶的成本、原料到乙醇的产率和投资是总生产 成本中的主要成本因素（Kumar，S.Chem. Eng. Technol. 32(2009)517-526)。迄今为止，通过 应用来自单一微生物来源或来自多种微生物来源（W0 2008/008793)的具有更宽和/或更 高（特异性）水解活性的酶产物来实现酶使用成本降低，使用所述酶目的在于更低的酶需 求、更快的转化速率和/或更高的转化产率和因而总体上更低的生物乙醇生产成本。这需 要在研宄和开发这些酶产物中的大量投资。在由来自多种微生物来源的酶构成的酶产物情 况下，生产各单个酶化合物需要大的资本投资。
[0011] 因此期望改进涉及水解和发酵的上述方法。
[0012] 来源于Talaromyces的热稳定纤维素分解酶已被用于降解木质纤维素原料，已知 这些酶具有热稳定性（在W02007091231中）。然而，没有给出怎样优化水解和发酵方法的 公开。
[0013] 发明概沐
[0014] 本发明的一个目的是提供用于水解含纤维素的生物质的方法，其包括：
[0015]-液化步骤，其中加入第一酶或第一酶组合物以液化所述生物质中存在的至少部 分固体并在所述液化步骤中将所述含纤维素的生物质的粘度保持在低于lOOOcP、优选地低 于800cP、更优选地低于600cP;然后
[0016]-糖化步骤，其中加入第二酶组合物以形成低聚糖和/或单体糖；以及
[0017] 其中，所述第一酶或第一酶组合物与所述第二酶组合物不同；
[0018] 其中，所述第一酶或第一酶组合物包含内切葡聚糖酶；
[0019] 其中，所述第二酶组合物包含纤维素酶；和
[0020] 其中，所述第一酶或第一酶组合物比所述第二酶组合物包含更多的内切葡聚糖酶 (以蛋白质重量％表示）。
[0021] 本发明的另一个目的是提供用于水解含纤维素的生物质的方法，其包括：
[0022] -液化步骤，其中加入第一酶或第一酶组合物以液化所述生物质中存在的至少部 分固体并在所述液化步骤中获得至少2、至少4、至少6、至少10、至少15或至少20的粘度 降低因子（viscosity reduction factor);然后
[0023]-糖化步骤，其中加入第二酶组合物以形成低聚糖和/或单体糖；以及
[0024] 其中，所述第一酶或第一酶组合物与所述第二酶组合物不同；
[0025] 其中，所述第一酶或第一酶组合物包含内切葡聚糖酶；
[0026] 其中，所述第二酶组合物包含纤维素酶；和
[0027] 其中，所述第一酶或第一酶组合物比所述第二酶组合物包含更多的内切葡聚糖酶 (以蛋白质重量％表示）。
[0028] 优选地，液化步骤发生在这样的反应器（液化反应器）中，其体积小于糖化步骤所 发生的反应器（糖化反应器）的体积，优选地，所述液化反应器的体积与所述糖化反应器的 体积的比率在1 : 2和1 : 50之间，更优选地在1 : 3和1 : 40之间。
[0029] 根据本发明的另一方面，液化反应器和/或糖化反应器的体积大于lm3,优选地体 积在10-5000m3之间。
[0030]有利地，与形成低聚糖和/或单体糖的步骤中或单体糖水解反应器中相比，在液 化步骤中或在液化反应器中，每反应器体积加入较少的酶（基于蛋白质干物质）。
[0031] 根据本发明的另一方面，第二酶组合物包含至少两种不同的纤维二糖水解酶和任 选地0 _葡糖苷酶和/或GH61。
[0032] 优选地，第一酶或第一酶组合物和/或第二酶或酶组合物包含热稳定酶。
[0033] 根据一个优选的实施方式，以补料分批、半连续或连续模式，更优选地以连续模式 完成液化步骤。
[0034] 根据另一个优选的实施方式，以补料分批、半连续或分批模式，更优选地以分批或 补料分批模式完成糖化步骤。
[0035] 在液化步骤中，优选地维持干物质含量为5重量％或更高、8重量％或更高、10重 量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重 量％或更高、20重量％或更高、25重量％或更高、30重量％或更高、35重量％或更高或40 重量％或更高，以及优选地低于42重量％。
[0036] 优选地，液化步骤在50°C或更高、55°C或更高、60°C或更高、65°C或更高、或者 70°C或更高的温度下进行；更优选地，液化步骤在65°C -110°C之间、甚至更优选地在 65°C -90°C之间、仍然更优选地在65°C -80°C之间且最优选地在70°C -80°C之间的温度下进 行。
[0037] 附图简沐
[0038] 图1:利用内切葡聚糖酶预液化的效果。
[0039] 图2:在不同温度（（?=62°C，A=70°C，#=75°C)下，木质纤维素原料液化期 间的粘度下降。
[0040] 发明详沐
[0041] 本发明涉及在水解含纤维素的生物质的方法中降低操作成本，例如酶成本、反应 器成本和能量成本。可通过使用较少酶来降低酶成本并同时维持高生产结果例如高水平的 糖、乙醇、生物气或其它期望产物（全部与已知水解工艺相比）。可通过选择导致与已知水 解工艺相比较小的总反应器体积的工艺条件来降低反应器成本。根据本发明，通过至本发 明方法的能量供应需要较低可实现节能。
[0042] 太质纤维素材料
[0043] 本文中的木质纤维素材料包括任何木质纤维素材料和/或半纤维素材料。适于 用作本发明原料或含纤维素材料的木质纤维素材料包括生物质，例如原初生物质（virgin biomass)和/或非原初生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃 物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛（shrubs)和草，小麦，麦秸， 甘鹿澄，柳枝稷，芒草（miscanthus)，玉米，玉米杆（corn stover)，玉米壳，玉米芯（corn cobs)，芸苔莖，大豆莖，高粱，玉米粒（包括来自玉米粒的纤维），来自谷物如玉米、小麦和 大麦研磨（包括湿磨和干磨）的通常称作"麸或纤维"的产物和副产物，以及市政固体废 弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物， 市政固体废弃物，废纸，和浆和造纸厂残余物。"农业生物质"包括树枝，灌木（bushes)，藤 蔓（canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，叶，树皮，针叶，原 木，根，树苗，短期轮种木本作物（short-rotation woody crops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬 菜，水果皮，蔓藤（vines)，甜菜衆，小麦麸皮(wheat midiings)，燕麦壳，和硬木材和软木材 (不包括带有有害材料的木材）。另外，农业生物质包括由农业加工产生的有机废弃物材 料，所述农业加工包括农业和林业活动，尤其包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述 任一或其任何组合或混合物。
[0044] 预处理
[0045] 任选地，原料可以以本领域中已知的任何方式用热、机械、微生物、酶促和/或化 学改性或这些方法的任何组合预处理，以增强底物对酶促水解的可及性和/或水解半纤维 素和/或使半纤维素和/或纤维素和/或木质素溶解。在一种实施方式中，通过用蒸汽喷 发、热水处理或用稀酸或稀碱处理