的水解、发酵和真空蒸馏后剩余的纤维素分解活性。酶的总活性在三个连续的方法步骤期 间以10-15个底物单位/g干物质原料降低且不依赖于初始的酶剂量。真空蒸馏后获得的糟 水可因而被再利用作为酶来源，用于将预处理麦秸转化为乙醇的新开始的水解-发酵-蒸 馏处理循环。糟水可被以浓缩形式或（未）稀释形式和/或被纯化并有或没有额外的酶补 充的形式被使用。糟水（任选地纯化的糟水）可被再利用于纤维素材料的液化或水解。
[0168] 通过下述实施例进一步描述本发明，其不应被解释为限制本发明的范围。 实施例
[0169] 材料&方法
[0170] 粘度测丨宙
[0171] 使用带有塑料桨（paddle)的NewportRVA-4快速粘度分析仪进行RVA(快速粘度 分析仪）测量（参见：D.L. Goode等人，JournaloftheInstituteofBrewing，第 111 卷， 第 2 期，2005)。
[0172] 廬
[0173] 根据W02011/000949中所述的接种和发酵程序发酵TEC-210纤维素酶组合物。
[0174] Rasamsonia (Talaromyces) emersonii 菌株于 1964 年 12 月保藏在荷兰真菌培养 物保藏中心（CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES)乌普萨兰 8, P.O.Box 85167， NL-3508AD乌特勒支，荷兰，登录号为CBS 393. 64。
[0175] 本实施例中可同样使用其它合适菌株以显示本发明的效果和优势。例如， TEC-101、TEC-147、TEC-192、TEC-201 或 TEC-210 是合适的 Rasamsonia 菌株，它们在 W02011/000949 被描述。
[0176] 通过如下产生内切葡聚糖酶（EG):如W02011/098577中所述在Aspergillus niger 中过表达 EBA8，随后发酵 Aspergillus niger 转化体。EBA8 是 Rasamsonia emersonii(Talaromyces emersonii)内切葡聚糖酶，其在 W02011/098577 中被鉴定为 T.emersonii0-葡聚糖酶 CEA(EG)且在 TO2011/098577 中由 SEQ ID N0:3 表示。
[0177] 制各酸预处理的玉米轩底物
[0178]如Schell，D. J.，Applied Biochemistry and Biotechnology (2003)，105-108卷， 69-85页中所述获得稀酸预处理的玉米杆（aCS)。使用中试规模预处理反应器，并在190°C、 1分钟停留时间和液相中1. 45% (重量/重量）的有效H2S04酸浓度的稳态条件下操作。
[0179] 实施例1
[0180] 太质纤维素原料水解期间内切葡聚糖酶的效果
[0181] 根据下述程序描述木质纤维素原料水解期间内切葡聚糖酶的效果。利用酸预处理 的玉米杆（aCS)原料进行水解反应。用4M NaOH溶液将原料的pH调节至pH 4. 5。以2个 阶段进行水解反应：
[0182] 1.以半连续模式操作的液化步骤
[0183] 2.以分批模式操作的糖化步骤
[0184] 如下进行液化：用1kg 10% (重量/重量）预处理的玉米杆原料填充液化反应器。 在恒定搅拌、pH控制（pH 4.5,4N NaOH)和62°C下操作反应器。填充后，直接定量加入（参 见表1)酶以启动水解反应。接下来，在恒定排出反应器内容物的条件下，每10分钟向液化 反应器中加入55g额外量的30%干物质原料以保持反应器填充水平恒定在1升。此外，另 外的酶与额外原料一起定量加入以在反应期间维持恒定的酶/底物比。约3小时后，反应 器中达到约20% (重量/重量）的干物质水平，且加入的原料干物质降低至20% (重量/ 重量）以保持反应器中的干物质水平在约20% (重量/重量）。开始液化后6小时，将液 化反应器的排出物引入糖化反应器中用于进一步处理。在液化反应器中的停留时间为平均 约3小时。
[0185] 如下进行糖化：用来自液化反应器的排出物填充糖化反应器至总反应体积为约1 升。这耗费约3小时。在恒定搅拌、pH控制（pH 4.5,4N NaOH)和62°C下操作反应器。在 填充期间，如表1中所示，在一个实验中同时加入酶。糖化反应进行约70小时。
[0186] 表1:酶剂量方案
[0187]
[0188] ?纤维素酶混合物：TEC-210
[0189] ?内切葡聚糖酶：EBA8
[0190] ?酶剂量：mg TCA蛋白质/g原料干物质
[0191] 水解之后，在冰上冷却样品并立即在1450 yl I级水中稀释50 yl每种上清液。随 后过滤稀释的上清液（0.45 ym滤器，Pall PN 454)并如下所述分析滤液的糖含量。
[0192] 如下测量稀释样品的糖浓度：使用带有Aminex HPX-87P柱（Biorad#1250098)的 HPLC，用85°C水以0. 6ml/分钟的流速洗脱，通过整合利用葡萄糖标准溶液校正的来自示差 折光检测（R.I.)的葡萄糖信号来定量。
[0193] 图1中展示的数据显示：与来自同时加入内切葡聚糖酶和TEC-210纤维素酶混合 物的原料的葡萄糖释放相比，来自用内切葡聚糖酶预处理的原料的葡萄糖释放较快并导致 较高水平（例如，72小时之后）。
[0194] 基于这些结果，结论是：利用含内切葡聚糖酶的酶组合物液化木质纤维素原料改 善了纤维素酶混合物的纤维分解性能。
[0195]实施例2
[0196] 液化步骤中内切葡聚糖酶的效果
[0197] 在Newport RVA-4中，在62°C下，以低搅拌速率预加热水中的pH为4. 5的20%干 物质预处理的原料的样品（酸预处理的玉米杆）持续1小时。在测量时间=〇时加入酶， 在62°C下在随后的2小时期间记录粘度降低并通过连接的电脑登记。
[0198] 表2中展示的结果显示：EG(EBA8)改进了生物质底物的粘度降低，且分批启动程 序可被用于启动本发明的方法。
[0199]表2
[0200]
[0201] 实施例3
[0202] 温度对木质纤维素原料液化的影响
[0203] 这个实验证明了温度对通过内切葡聚糖酶的木质纤维素原料液化的影响。使用获 自NREL(国家可再生能源实验室）的酸预处理的玉米杆原料（aCS)进行液化实验。
[0204] 在Newport RVA-4中，以低搅拌速率预热水中的pH为4. 5的24 %干物质预处理的 原料的样品持续1小时。在测量时间=〇时加入酶（〇. 2mg EG[EBA8]/g干物质），在随后的 60分钟期间记录粘度降低并通过连接的电脑登记。在62°C、70°C和75°C下进行孵育。
[0205] 表2中展示的结果显示：EG(EBA8)能够在高达75°C的温度下液化木质纤维素原 料，且较高温度导致较低粘度。
【主权项】
1. 用于水解含纤维素的生物质的方法，其包括： -液化步骤，其中加入第一酶或第一酶组合物以液化所述生物质中存在的至少部分固 体并使得在所述液化步骤中所述含纤维素的生物质的粘度保持在低于lOOOcP、优选地低于 800cP、更优选地低于600cP;然后 -糖化步骤，其中加入第二酶组合物以形成低聚糖和/或单体糖；以及 其中，所述第一酶或第一酶组合物与所述第二酶组合物不同； 其中，所述第一酶或第一酶组合物包含内切葡聚糖酶； 其中，所述第二酶组合物包含纤维素酶；和 其中，所述第一酶或第一酶组合物比所述第二酶组合物包含更多的内切葡聚糖酶（以 蛋白质重量％表示）。2. 根据权利要求1的方法，其中所述液化步骤发生在反应器（液化反应器）中，所述反 应器的体积小于发生所述糖化步骤的反应器（糖化反应器）的体积，优选地，所述液化反应 器的体积与所述糖化反应器的体积的比率在1:2和1:50之间，更优选地在1:3和1:40之 间。3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述液化反应器和/或所述糖化反应器的体积大 于lm3,优选地体积在10-5000m3之间。4. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述第二酶组合物包含至少两种不同的纤 维二糖水解酶和任选地0 -葡糖苷酶和/或GH61。5. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其中与形成低聚糖和/或单体糖的步骤中或单 体糖水解反应器中相比，在所述液化步骤中或在所述液化反应器中，每反应器体积加入较 少的酶（基于蛋白质干物质）。6. 根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述第一酶或第一酶组合物和/或所述第 二酶或酶组合物包含热稳定酶。7. 根据权利要求1-6中任一项的方法，其中以补料分批、半连续或连续模式，优选地以 连续模式完成所述液化步骤。8. 根据权利要求1-7中任一项的方法，其中以补料分批、半连续或分批模式，优选地以 补料分批或分批模式完成所述糖化步骤。9. 根据权利要求1-8中任一项的方法，其中在所述液化步骤中维持干物质含量为5重 量％或更高、8重量％或更高、10重量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重 量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、20重量％或更高、25重量％或更高、30重 量％或更高、35重量％或更高、或40重量％或更高且优选地低于42重量％。10. 根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述液化步骤在50°C或更高、55°C或 更高、60°C或更高、65°C或更高、或者70°C或更高的温度下进行；优选地，所述液化步骤在 65°C-IKTC之间、更优选地在65°C-90°C之间、仍然更优选地在65°C-80°C之间且最优选地 在70°C-80°C之间的温度下进行。
【专利摘要】本发明涉及水解含纤维素的生物质的方法，其包括：·液化步骤，其中加入第一酶或第一酶组合物以液化所述生物质中存在的至少部分固体并在所述液化步骤中将所述含纤维素的生物质的粘度保持在低于1000cP、优选地低于800cP、更优选地低于600cP；随后是·糖化步骤，其中加入第二酶组合物以形成低聚糖和/或单体糖；以及·其中，所述第一酶或第一酶组合物与所述第二酶组合物不同；·其中，所述第一酶或第一酶组合物包含内切葡聚糖酶；·其中，所述第二酶组合物包含纤维素酶；以及·其中，所述第一酶或第一酶组合物比所述第二酶组合物包含更多的内切葡聚糖酶(以蛋白质重量％表示)。
【IPC分类】C13K1/02, C12P19/14, C12P19/02
【公开号】CN104903462
【申请号】CN201480004356
【发明人】约翰尼斯·彼得吕斯·斯米特斯, 迈克尔·彼得勒斯·乔瑟夫·贝克浩特, 伯图斯·诺丹姆
【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年1月9日
【公告号】CA2896251A1, EP2943577A1, US20150322471, WO2014108454A1