木质纤维素进行预处理。
[0046] 清洗步驟
[0047] 任选地，根据本发明的方法包括清洗步骤。任选的清洗步骤可被用来去除可能作 为发酵步骤的抑制剂的水溶性化合物。清洗步骤可以以已知的方式进行。
[0048] 液化步驟
[0049] 根据本发明的方法包括原料的液化。在该步骤中，使任选地预处理的和任选地清 洗的木质纤维素材料与第一酶或第一酶组合物接触。
[0050] 根据木质纤维素材料和预处理，技术人员可调节不同的反应条件例如温度、酶剂 量、水解反应时间和干物质浓度，以实现期望的木质纤维素转化。一些指标在下文给出。
[0051] 优选地，在液化步骤中，加入第一酶或第一酶组合物以液化生物质中存在的至 少部分固体并在该步骤中使含纤维素的生物质的粘度保持在低于1000CP、优选地低于 800cP、更优选地低于600cP。优选地，在该步骤中，含纤维素的生物质的干物质含量在 12-35重量％之间、更优选地在15-30重量％之间。
[0052] 干物质含量为5%或更高（例如，20重量％ )的含纤维素的生物质的粘度将高于 1000cP，例如 2000cP。
[0053] 根据另一个优选的实施方式，在液化步骤中加入第一酶或第一酶组合物以液化所 述生物质中存在的至少部分固体从而在所述液化步骤中获得至少2、至少4、至少6、至少 10、至少15或至少20的粘度降低因子。通常，粘度降低因子将小于50。粘度降低因子表 示：进入液化步骤的生物质的粘度除以离开液化步骤的生物质的粘度（cP/cP)。
[0054] 为了在液化步骤中获得高固体含量和低粘度，在启动阶段，液化反应器可包含的 水和含纤维素的生物质（和第一酶或第一酶组合物）的量使得粘度低于1000CP、优选地低 于800CP、更优选地低于600CP。在粘度由于加入的酶而降低之后，可加入更多的含纤维素 的生物质，从而液化步骤中的干物质含量将增加。可进行该启动程序直至达到液化反应器 中期望的干物质含量。随后，可以以补料分批、半连续或连续模式继续液化步骤。
[0055] 另一种启动方式是下述程序，其中液化步骤中含纤维素的生物质的初始粘度高于 500cP。在该程序中，仅在第一酶或第一酶组合物已使粘度降低至低于1000CP、优选地低于 800cP、更优选地低于600cP后，以补料分批、半连续或连续模式继续液化步骤。在该程序 中，在启动阶段中有利地的是，在启动阶段中定量加入（每含纤维素的生物质的干物质量） 比随后的补料分批、半连续或连续模式中更多的第一酶或第一酶组合物。
[0056] 在液化步骤中加入的第一酶或第一酶组合物与糖化步骤中使用的第二酶组合物 不同。
[0057] 第一酶或第一酶组合物包含内切葡聚糖酶。
[0058] 第一酶或第一酶组合物包含多于第二酶组合物的内切葡聚糖酶（以蛋白质重 量％表示）。
[0059] 在本发明的一方面，液化步骤在50°C或更高、55°C或更高、60°C或更高、65°C或 更高、或者70°C或更高的温度下进行；优选地，液化步骤在65°C -110°C之间、更优选地在 65°C -90°C之间、仍然更优选地在65°C -80°C之间且最优选地在70°C -80°C之间的温度下进 行。液化期间的高温具有许多优势，包括：在酶组合物的最适温度下进行、降低（细菌）污 染的风险、酶活性较高、液化步骤后粘度较低、液化步骤期间粘度下降较多、需要较少量冷 却水、使用较高温度的冷却水、酶的再使用较容易和更多优势（所有优势相对于在液化步 骤中采用较低温度的情况）。
[0060] 在本发明的另一方面，加入的第一酶或第一酶组合物的量（在本文中也称为酶剂 量或酶载量）低。在一种实施方式中，在液化步骤中加入的酶的量为6mg蛋白质/g干物质 重量或更低、5mg蛋白质/g干物质或更低、4mg蛋白质/g干物质或更低、3mg蛋白质/g干物 质或更低、2mg蛋白质/g干物质或更低或lmg蛋白质/g干物质或更低（表示为mg蛋白质 /g干物质形式的蛋白）。在一种实施方式中，酶量为〇. 5mg酶/g干物质重量或更低、0. 4mg 酶组合物/g干物质重量或更低、0. 3mg酶/g干物质重量或更低、0. 25mg酶/g干物质重量 或更低、〇? 20mg酶/g干物质重量或更低、0? 18mg酶/g干物质重量或更低、0? 15mg酶/g干 物质重量或更低或〇. l〇mg酶/g干物质重量或更低（表示为mg酶/g干物质形式的总纤维 素酶）。
[0061] 在本发明的另一方面，液化时间为10小时或更短、5小时或更短、3小时或更短、或 2小时或更短。在另一方面，液化时间为10小时至1分钟、5小时至3分钟或3小时至5分 钟。由于酶或酶组合物的稳定性，酶或酶组合物将在接下来的（糖化）步骤中保持活性。
[0062] 液化期间的pH可由技术人员选择。在本发明的另一个方面中，液化期间的pH可以 是3. 0-6. 4。本发明的稳定酶可被选择为具有高达2个pH单位、高达3个pH单位、高达5 个 pH 单位的宽 pH 范围。最适 pH 可位于 pH 2. 0-8. 0、3. 0-8. 0、3. 5-7. 0、3. 5-6. 0、3. 5-5. 0、 3. 5-4. 5、4. 0-4. 5的界限内或为约4. 2。
[0063] 显著地，本发明的方法可在液化步骤中使用高水平的（木质纤维素材料的）干物 质进行。因此，本发明可利用5重量％或更高、8重量％或更高、10重量％或更高、11重量％ 或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、20重量％ 或更高、25重量％或更高、30重量％或更高、35重量％或更高、或40重量％或更高且优选 地低于42重量％的干物质含量进行。在另一种实施方式中，液化步骤中的干物质含量是 14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22 重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％、30重 量％、31重量％、32重量％、33重量％或更多或14-33重量％。
[0064] 优选地，液化反应器的体积为lm3或更大、优选地大于10m3且最优选地50m3或更 大。通常，液化反应器将小于3000m3或5000m3。
[0065] 糖化
[0066] 根据本发明的方法包括酶促糖化步骤。酶促水解包括但不限于为了水解为了从液 化的原料释放糖的水解。在该步骤中，维持任选地预处理的和任选地清洗的木质纤维素材 料在液化后与第二酶组合物接触。
[0067] 根据木质纤维素材料、预处理和液化步骤，技术人员可调节不同的反应条件例如 温度、存在或任选地定量加入的酶、水解反应时间和干物质浓度，以实现木质纤维素向糖的 期望转化。一些指标在下文给出。
[0068] 在糖化步骤中，加入第二酶组合物以形成低聚糖和/或单体糖；且第二酶组合物 包含纤维素酶。第二酶组合物优选地包含至少两种不同的纤维二糖水解酶和任选地葡 糖苷酶和/或GH61。
[0069] 在本发明的一方面，糖化在50°C或更高、55°C或更高、60°C或更高、65°C或更高、或 者70°C或更高的温度下进行。水解期间的高温具有许多优势，包括：在酶组合物的最适温 度下进行、降低（细菌）污染的风险、需要较少量冷却水、使用较高温度的冷却水、酶的再使 用和更多优势。
[0070] 在本发明的另一方面，任选加入的第二酶组合物的量（在本文中也称为酶剂量或 酶载量）低。在一种实施方式中，在糖化步骤中加入的酶的量为6mg蛋白质/g干物质重量 或更低、5mg蛋白质/g干物质或更低、4mg蛋白质/g干物质或更低、3mg蛋白质/g干物质或 更低、2mg蛋白质/g干物质或更低、或lmg蛋白质/g干物质或更低（表示为mg蛋白质/g 干物质形式的蛋白）。在一种实施方式中，酶量为〇. 5mg酶/g干物质重量或更低、0. 4mg酶 组合物/g干物质重量或更低、0. 3mg酶/g干物质重量或更低、0. 25mg酶/g干物质重量或 更低、0? 20mg酶/g干物质重量或更低、0? 18mg酶/g干物质重量或更低、0? 15mg酶/g干物 质重量或更低、或0. l〇mg酶/g干物质重量或更低（表示为mg酶/g干物质形式的总纤维 素酶）。低酶剂量是可行的，因为由于酶的活性和稳定性，可以增加糖化反应时间。
[0071] 在本发明的另一个方面中，糖化步骤中的糖化反应时间为40小时或更长、50小时 或更长、60小时或更长、70小时或更长、80小时或更长、90小时或更长、100小时或更长、120 小时或更长、130小时或更长。在另一方面中，水解反应时间为40-130小时、50-120小时、 60-120小时、60-110小时、60-100小时、70-100小时、70-90小时或70-80小时。由于酶组 合物的稳定性，更长水解反应时间是可以的，这对应更高的糖产率。
[0072] 在糖化步骤中，水解期间的pH可由技术人员选择。在本发明的另一个方面中，水 解期间的pH可以是3. 0-6. 4。本发明的稳定酶可具有高达2个pH单位、高达3个pH单位、 高达5个pH单位的宽pH范围。最适pH可位于pH 2.0-8. 0、3. 0-8. 0、3. 5-7. 0、3. 5-6. 0、 3. 5-5. 0、3. 5-4. 5、4. 0-4. 5 的界限内或为约 4. 2。
[0073] 在本发明的另一个方面中，进行糖化步骤直到木质纤维素材料中的70%或更多、 80 %或更多、85 %或更多、90 %或更多、92 %或更多、95 %或更多的可利用糖被释放。
[0074] 显著地，本发明的方法可在糖化步骤中使用高水平的（木质纤维素材料的）干物 质进行。因此，本发明可利用5重量％或更高、8重量％或更高、10重量％或更高、11重量％ 或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、20重量％ 或更高、25重量％或更高、30重量％或更高、35重量％或更高、或40重量％或更高且优选 地低于42重量％的干物质含量进行。在另一种实施方式中，糖化步骤中的干物质含量是 14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22 重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％、30重 量％、31重量％、32重量％、33重量％或更多或14-33重量％。
[0075] 优选地，糖化反应器的体积为lm3或更大、优选地大于10m 3且最优选地50m 3或更 大。通常，糖化反应器小于3000m3或5000m3。
[0076] 在最伟温度条件下使用热稳定酶
[0077] 在一种实施方式中，本发明涉及在分离的液化和糖化（SLS)工艺中使用热稳定酶 (例如Talaromyces的纤维素分解酶），用于在（但不限于）乙醇生产中从预处理的木质纤 维素原料生产还原糖。应用于预处理的木质纤维素原料的Talaromyces的纤维素分解酶显 示出在50-70°C范围内的温度下的最大转化速率。酶在这些环境下保持活性达14天及更 久，而没有完全停止活性。
[0078] 通过使用最佳温度条件，最大量的还原糖能在尽